HILIC Analysis of CRISPR-Cas9 Gene Editing Tools on a Low Adsorption LC Flow Path

Význam tématu

Hydrofobně interakční chromatografie (HILIC) se ukazuje jako ekologičtější a doplňková alternativa k iontově párované reverzní fázi při separaci oligonukleotidů. V oblasti editace genů CRISPR‐Cas9 je klíčové přesné profilování enzymatických štěpných produktů (sgRNA, mRNA), přičemž nespecifická adsorpce kovy pasivních kovových povrchů LC systému může výrazně ovlivnit citlivost, reprodukovatelnost a kvalitu dat.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo porovnat výkon konvenční HILIC‐Z kolony z nerezové oceli se speciálně deaktivovanou verzí při analýze štěpných produktů oligonukleotidů (sgRNA, Cas9 mRNA). Studie hodnotila nutnost pasivace, vliv terminálních fosfátových skupin a dopad enzymatických úprav (CNP, CIP) na chromatografický průběh a obnovu signálu.

Použitá metodika

Vzorky zahrnovaly standardní RNA oligonukleotidy, vlastní 50nt modelový RNA řetězec, sgRNA (104 nt) a mRNA Cas9 (4522 nt). Digestion probíhal pomocí RNase T1 nebo RNase 4 při 37 °C s následnou enzymatickou úpravou cyklických a lineárních fosfátů pomocí CNP a CIP. Chromatografie byla prováděna v režimu HILIC s mobilními fázemi 20 mM acetát amonný ve vodě:acetonitrilu (20:80 a 80:20 v/v), průtokem 0,35 mL/min, teplotou kolony 40 °C a detekcí UV při 260 nm.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity III Bio LC System: High‐Speed Pump, Multisampler s termostatem, Multicolumn Thermostat, DAD detektor
• Agilent InfinityLab Poroshell HILIC‐Z kolony 2,1×150 mm, 2,7 µm; standardní i Ultra Inert verze

Hlavní výsledky a diskuse

Deaktivovaná HILIC‐Z kolona vykazovala stabilní UV signál již při první injekci, zatímco konvenční nerezová kolona potřebovala ~25 injekcí k dočasné pasivaci. U vzorků s lineárním 3'-fosfátem byla adsorpce na nerez výrazná, což vedlo k nižšímu intenzitnímu signálu a špatnému tvaru piků. Úprava CNP/CIP vedla k odstranění lineárních fosfátů, čímž se zlepšila chromatografie na konvenční koloně, avšak deaktivovaná kolona stále poskytovala ostřejší a intenzivnější píky. Cyklické fosfátové terminály a 3'-hydroxylové konce vykazovaly nižší tendenci k adsorpci.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost a reprodukovatelnost analýz oligonukleotidů v RNA mappingu
• Snížení potřeby mobilních fází s metal chelaty, které mohou snižovat MS odezvu
• Možnost rychlejšího nasazení metody bez nutnosti dlouhodobé pasivace kolony

Budoucí trendy a možnosti využití

Optimalizace povrchových úprav kovových komponent pro trvalé potlačení adsorpce oligonukleotidů může snížit závislost na enzymatických úpravách vzorků. Integrace HILIC s vysokorozlišovací hmotovou spektrometrií a automatizované pasivační protokoly přispěje k rychlejšímu vývoji a kontrole kvality pokročilých mRNA léčiv.

Závěr

Deaktivované kolony HILIC‐Z na nerezové oceli významně redukují nespecifickou adsorpci a umožňují konzistentnější separaci a detekci oligonukleotidů. Enzymatické úpravy terminálních fosfátů přinášejí další zlepšení, ale nejefektivnější je nasazení inertního povrchu kolony pro robustní analytické workflow.

Reference

1. Sahin U, Karikó K, Türeci Ö. mRNA-Based Therapeutics—Developing a New Class of Drugs. Nat Rev Drug Discov. 2014;13(10):759–780.
2. Maurer J, Vanluchene H, Tsalmpouris A et al. Exploring the Potential of Oligonucleotide Mapping with LC-MS to Study the Primary Structure of mRNA. TrAC Trends Anal Chem. 2025;191:118309.
3. Lardeux H, D'Atri V, Guillarme D. Recent Advances and Current Challenges in HILIC for the Analysis of Therapeutic Oligonucleotides. TrAC Trends Anal Chem. 2024;176:117758.
4. Vanhoenacker G et al. Determining mRNA Capping with HILIC-MS on a Low-Adsorption Flow Path. Agilent Technologies Application Note. 2024.
5. Vanluchene H et al. mRNA Mapping with IP-RPLC-MS on a Low-Adsorption Flow Path. Agilent Technologies Application Note. 2025.
6. Bartlett MG. Current State of HILIC of Oligonucleotides. J Chromatogr A. 2024;1736:465378.
7. Goyon A et al. Full Sequencing of CRISPR-Cas9 sgRNA via Parallel Ribonuclease Digestions and HILIC–HRMS Analysis. Anal Chem. 2021;93(44):14792–14801.
8. Goyon A et al. Online Nucleotide Mapping of mRNAs. Anal Chem. 2024;96(21):8674–8681.
9. Wolf EJ et al. Human RNase 4 Improves mRNA Sequence Characterization by LC–MS/MS. Nucleic Acids Res. 2022;50(18):e106.