Determining mRNA Capping with HILIC-MS on a Low-Adsorption Flow Path

Význam tématu

mRNA vakcíny se díky pandemii staly průlomovou technologií v oblasti biopharma. Klíčovou vlastností mRNA je 5′-cap struktura, která ovlivňuje stabilitu, translaci a celulární transport. Kvantifikace inkorporace capu (CQA) vyžaduje citlivé analytické metody, včetně LC-MS. Tradiční HILIC analýza však trpí významnou ztrátou citlivosti a špatným tvarem chromatografických piků v důsledku adsorpce fosfátových zbytků na kovové povrchy.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři prezentují postup pro stanovení cappingu mRNA s využitím HILIC-MS na nízkoadsorpčním LC flowpath. Cílem bylo porovnat standardní kovové (stainless steel) a biokompatibilní (PEEK-lined) průchod plynů a vyhodnotit dva protokoly izolace 5′-terminálních fragmentů (RNase H- a RNase A/T1-založený). Studie demonstruje, jak kovové povrchy snižují citlivost a zkreslují chromatografii a jak je lze eliminovat použitím PEEK-vybavení.

Použitá instrumentace

• LC systémy Agilent 1290 Infinity II (stainless steel) a Infinity II Bio LC (biokompatibilní)
• Diol HILIC kolona (2,1×100 mm, 1,9 µm) ve standardní kovové a PEEK-lined variantě
• Q-TOF MS: Agilent 6545 LC/Q-TOF, negative ESI, rozsah m/z 400–3200
• RNázy: thermostabilní RNase H (New England Biolabs), RNase A (Thermo Fisher), RNase T1
• Hybridizační probe s biotinem, streptavidinové magnetické kuličky
• Eluční pufry: 20 mM amonný acetát ve vodě/acetonitrilu

Hlavní výsledky a diskuse

1. PEEK-lined kolona výrazně zlepšuje reprodukovatelnost, citlivost a tvar piků oproti kovové.
2. Na kovové koloně se signál oligonukleotidů zvyšuje až po několika vstupech a je výrazně oslabený.
3. Při porovnání HILIC na kovovém vs PEEK-lined flowpath byly 5′-terminální fragmenty mRNA detekovatelné pouze na nízkoadsorpčním systému.
4. RNase H metoda umožňuje izolaci single-stranded koncového fragmentu bez 3′-fosfátu, zatímco RNase A/T1 uvolňuje fosforylovaný fragment s provisořeným duplexním stavem.
5. MS spektra obsahují rozptýlení signálu do více nábojových stavů a aduktů; nízkoadsorpční protokol minimalizuje ztráty a zlepšuje citlivost.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivé stanovení cappingu mRNA jako CQA pro biopharma a výzkum.
• Odstranění potřeby ion-pair reagentů a snížení kontaminace LC/MS.
• Vhodné pro kvalitativní i kvantitativní sledování inkorporace capu během IVT procesu.
• Zjednodušená údržba přístrojů bez kontinuálního čištění kovových povrchů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší nasazení HILIC-MS s nízkoadsorpčními systémy pro analýzu různých typů RNA a DNA terapeutik.
• Automatizace vzorkového zpracování a online čištění.
• Rozvoj deponovaných povrchových úprav a nových polymerních materiálů pro LC.
• Integrace se sekvenčními MS/MS metodami pro detailní charakterizaci strukturálních variant capu.

Závěr

Nasazení PEEK-lined low-adsorption flow path v kombinaci s HILIC-MS odstraňuje zásadní omezení kovových povrchů při analýze mRNA cap struktur. Výsledkem je vyšší citlivost, lepší tvar piku a reprodukovatelnost, což umožňuje spolehlivé stanovení cappingu jako kritické kvality biopharmaceutik.

Reference

1. Callaway E.; Naddaf M. Pioneers of mRNA COVID Vaccines Win Medicine Nobel. Nature 2023, 622, 228–229.
2. Beverly M. et al. Label-Free Analysis of mRNA Capping Efficiency Using RNase H Probes and LC-MS. Anal. Bioanal. Chem. 2016, 408, 5021–5030.
3. Liau B. Rapid Analysis of mRNA 5' Capping with High Resolution LC/MS. Agilent Technologies application note 5994-3984EN, 2021.
4. Morreel K. et al. Diving into the Structural Details of In Vitro Transcribed mRNA Using LC-MS-Based Oligonucleotide Profiling. LCGC Europe 2022, 35, 220–236.
5. Nwokeoji A. O. et al. Low Resource Integrated Platform for Production and Analysis of Capped mRNA. ACS Synth. Biol. 2023, 12, 329–339.
6. Wolf E. J. et al. Selective Characterization of mRNA 5' End-Capping by DNA-Probe Directed Enrichment with Site-Specific Endoribonucleases. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 2023, 6, 1692–1702.
7. Guimaraes G. J.; Kim J.; Bartlett M. G. Characterization of mRNA Therapeutics. Mass Spectrom. Rev. 2023.
8. Ramanathan A.; Robb G. B.; Chan S. H. mRNA Capping: Biological Functions and Applications. Nucleic Acids Res. 2016, 44, 7511–7526.
9. Daniel S. et al. Quality by Design for Enabling RNA Platform Production Processes. Trends Biotechnol. 2022, 40, 1213–1228.
10. USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality. USP guideline EA966W_2023-04, draft second edition.
11. Huang M. et al. Analytical Characterization of DNA and RNA Oligonucleotides by HILIC-MS/MS. J. Chromatogr. A. 2021, 1648, 462184.
12. Goyon A. et al. Characterization of Impurities in Therapeutic RNAs at the Single Nucleotide Level. Anal. Chem. 2022, 94, 16960–16966.
13. Li G.; Rye P. MS/MS Oligonucleotide Sequencing Using LC/Q-TOF with HILIC. Agilent application note 5994-5632EN, 2023.
14. Lardeux H. et al. The Impact of Low Adsorption Surfaces for the Analysis of DNA and RNA Oligonucleotides. J. Chromatogr. A. 2022, 1677, 463324.
15. Schneider S. Analysis of Phosphate Compounds with the Agilent 1260 Infinity Bio-Inert LC System. Agilent 5991-0025EN, 2012.
16. Sandra K. et al. Analysis of Nucleotides Using a Fully Inert Flowpath. Agilent 5994-0680EN, 2019.
17. Schneider S. Comparability Studies for the Analysis of Nucleotides on Four Different LC Systems. Agilent 5994-4392EN, 2021.
18. Vanhoenacker G. et al. Improving Peak Shape and Recovery in LC Studies of Phosphated Vitamin B2. Agilent 5994-5830EN, 2023.