Proteome wide interactomics analysis using MS-cleavable crosslinkers and the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer

Význam tématu

Crosslinkingová hmotnostní spektrometrie (XL-MS) se stala klíčovou metodou pro zjišťování vyšších struktur proteinů a mapování interakcí protein–protein (PPI) v rozsahu celého proteomu. Díky MS-štěpitelným crosslinkerům jako DSSO a DSBSO lze v MS/MS získat charakteristické fragmnetní ionty, které zvyšují důvěryhodnost identifikace vzácných crosslinkovaných peptidů. V praxi to otevírá možnost detailního studia komplexních biologických systémů, například ribozomů či velkých proteinových komplexů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat end-to-end workflow pro XL-MS s MS-štěpitelnými crosslinkery DSSO a DSBSO na platformě Orbitrap Astral Zoom MS. Autoři porovnali různé kolizní energie, akviziční režimy (top N vs. top speed) a délky LC gradientů (20, 30, 60 min), a to na vzorcích E. coli ribozomů a smíšeného proteinového komplexu složeného z 64 lidských proteinů. Vyhodnocena byla citlivost, průchodnost (throughput) a kvalita spekter.

Metodika

• Příprava vzorků: Crosslinkování E. coli ribozomů a 64 proteinového mixu s DSSO/DSBSO, následná redukce, alkylace, trypsinová digesce.
• Obohacení DSBSO: Bio-ortogonální zachycení na DBCO magnetických perličkách, odmytí nezkřížených peptidů.
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC se 75 µm × 25 cm EASY-Spray kolonkou; gradienty 20/30/60 min.
• MS akvizice: MS1 v Orbitrap, MS2 v Astral (Astral MS2) nebo Orbitrap (OT MS2); FAIMS třípolový režim.
• Optimalizace SCE: dvoukrokové a tříkrokové stepped collision energy režimy (např. SCE 25–32).
• Data analysis: Proteome Discoverer 3.2 s XlinkX node 3.2, MS1 tolerance 10 ppm, MS2 tolerance 20 ppm, FDR 1 % na úrovni crosslinků.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral Zoom hmotnostní spektrometr (Thermo Scientific)
• FAIMS Pro Duo rozhraní
• Vanquish Neo UHPLC systém s EASY-Spray kolonkou
• Proteome Discoverer 3.2 s XlinkX node 3.2
• Předúprava vzorků: Spin kolony pro desalting, BCA a fluorometrické stanovení koncentrace

Hlavní výsledky a diskuse

• Dvou-krokový režim SCE 25–32 přinesl až o 10 % více crosslinků než tříkrokové nastavení; top N režim zvýšil počet crosslinků o 5 % oproti top speed.
• Orbitrap Astral Zoom MS za kombinace MS1 Orbitrap/MS2 Astral identifikoval o 113 % více DSSO crosslinků (217 vs. 102) a o 57 % více DSBSO crosslinků (165 vs. 105) ve srovnání s klasickou OT MS1/MS2 akvizicí.
• Při 20min LC gradientu dosáhl Zoom MS stejných počtů crosslinků jako OT MS s 60min gradientem, čímž trojnásobně zvýšil throughput.
• Citlivost: Při poměru 1:10 (lidské proteiny vs. E. coli) detekoval Astral Zoom o 53 % více crosslinků a lidské crosslinky byly identifikovány až při poměru 1:50.
• Astral MS2 spektra poskytla vyšší počet sekvenčních fragmentů a zvýšila XlinkX skóre (z 79,9 na 101,3) a pokrytí sekvencí.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované workflow umožňuje rychlé a citlivé mapování PPI sítí v komplexních biologických vzorcích. Bio-ortogonální obohacení DSBSO zvyšuje detekci nízkoodběrových crosslinkovaných peptidů, což posouvá hranice proteomických aplikací v nativním prostředí buněk.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále zkracovat analýzy a zvyšovat throughput s využitím rychlých Astral Zoom akvizic.
• Rozšířit portfolio bio-ortogonálních affinitních značek a automatizovat obohacení.
• Vývoj pokročilých algoritmů pro exploataci vlastností MS-štěpitelných crosslinkerů.
• Masové nasazení v mapování PPI sítí a strukturním proteomickém výzkumu.

Závěr

Orbitrap Astral Zoom MS v kombinaci s DSSO a DSBSO přináší výrazné zlepšení v počtu i kvalitě crosslinkových identifikací, vyšší průchodnost a citlivost analýzy. Tato platforma významně přispívá k detailnímu chápání proteinových interakcí a struktur v proteomu.

Reference

1. Lenz S, Sinn LR, O’Reilly FJ, Fischer L, Wegner F, Rappsilber J. Reliable identification of protein-protein interactions by crosslinking mass spectrometry. Nat Commun. 2021;12(1):3564.
2. Kao A et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 2011;10(1):M110.002212.
3. Kaake RM et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 2014;13(12):3533–3543.
4. Clasen MA, Ruwolt M, Wang C et al. Proteome-scale recombinant standards and a robust high-speed search engine to advance cross-linking MS-based interactomics. Nat Methods. 2024;21(12):2327–2335.
5. Combe CW et al. xiVIEW: Visualization of Crosslinking Mass Spectrometry Data. J Mol Biol. 2024;436(17):168656.
6. Stieger CE, Doppler P, Mechtler K. Optimized Fragmentation Improves the Identification of Peptides Cross-Linked by MS-Cleavable Reagents. J Proteome Res. 2019;18(3):1363–1370.