Optimization of FAIMS-XL-MS Workflow for Phospho-Enrichable Crosslinkers

Význam tématu

Cross-linking mass spectrometry (XL-MS) se stává klíčovou technikou pro mapování protein-proteinových interakcí a strukturu makromolekulárních komplexů. Přidáním fáze plynné frakcionace pomocí FAIMS (high field asymmetric waveform ion mobility spectrometry) lze významně zvýšit selektivitu a citlivost analýzy, zvláště při práci s komplexními vzorky.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na benchmarkování a optimalizaci FAIMS-XL-MS workflow na platformě Orbitrap Exploris™ 240 pro dva typu crosslinkerů: DSSO (MS-cleavable) a PhoX-DSPP (phospho-enrichable). Cílem bylo stanovit ideální parametry iontové mobility, zdroje i kolizního buzení tak, aby došlo k maximálnímu zvýšení počtu identifikovaných crosslinků.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza zahrnovala následující kroky:

• Příprava vzorku: křížení E. coli ribozomálních proteinů disukcinimidylovými crosslinkery DSSO a PhoX-DSPP, následné redukce, alkylace, acetone presipitace a proteolytická štěpení (Lys-C/trypsin).
• Obohacení: PhoX-DSPP tryptických peptidů pomocí Fe-NTA agarózy nebo magnetických kuliček.
• LC-MS/MS: nanoLC s EASY-Spray kolonkou (75 µm × 25 cm, 75 min gradient) připojené k Orbitrap Exploris 240 s FAIMS Pro Duo.
• FAIMS parametry: optimalizace kompenzačního napětí (CV), rozlišení (SR, HR, uživatelem definované), teploty iontové trubice a výkonu zdroje (spray voltage).
• Analýza dat: Proteome Discoverer 2.5 s uzlem XlinkX 2.5 a SEQUEST®HT, databáze E. coli, 1 % FDR.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaná nastavení vedla k významnému nárůstu detekovaných crosslinků:

• Celkový průtok nosného plynu 0,9 L/min zajišťuje nejlepší poměr stabilita spreje a přenos iontů.
• Snížení spray voltage na 1500 V a teploty iontové trubice na 250 °C zvýšilo počet identifikací pro obě crosslinkery oproti standardním 2000 V/305 °C.
• Pro DSSO byly ideální CV hodnoty –45 V a –60 V (nárůst ~40 % crosslinků vs bez FAIMS).
• Pro PhoX-DSPP obohacené vzorky byly optimální CV –60 V a –75 V (o 10–14 % více crosslinků).
• Standardní rozlišení FAIMS (SR) poskytlo nejlepší bilanci mezi průchodností iontů a rozlišením spektra.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované FAIMS-XL-MS umožňuje:

• Výrazně zvýšit počet a kvalitu identifikovaných crosslinků v komplexních proteinových vzorcích.
• Snížit background a zlepšit selektivitu obohacovacích strategií pro fosfo-crosslinky.
• Uplatnit v mapování protein-proteinových interakcí na komplexní proteome.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se očekává v oblasti:

• Pokročilého uživatelsky definovaného rozlišení FAIMS pro specifické aplikace.
• Integrace umělé inteligence pro automatickou optimalizaci parametrů během akvizice.
• Aplikace nových obohacovacích chemikálií a multiplexních metod pro ještě širší pokrytí proteomu.

Závěr

Implementace a optimalizace FAIMS na Orbitrap Exploris 240 přinesla významné zvýšení výtěžnosti a spolehlivosti cross-linkingové hmotové spektrometrie. Metoda se jeví jako robustní nástroj pro hluboké mapování proteinových komplexů a interakcí.

Reference

1. Schnirch L., Nadler-Holly M., Siao S., Frese C., Viner R., Liu F. Expanding the Depth and Sensitivity of Cross-Link Identification by Differential Ion Mobility Using High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry. Analytical Chemistry, 2020, 92(15), 10495–10503.
2. Steigenberger B., Pieters R.J., Heck A., Scheltema R.A. PhoX: An IMAC-Enrichable Cross-Linking Reagent. ACS Central Science, 2019, 5(9), 1514–1522.
3. Cannon J.R. et al. Ultraviolet Photodissociation for Characterization of Whole Proteins on a Chromatographic Time Scale. Analytical Chemistry, 2014, 86(4), 2185–2192.