IMSC: Optimization of crosslinked peptide analysis on an Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer

Význam tématu

Analytika protein–protein interakcí pomocí chemického křížového vázání v kombinaci s hmotnostní spektrometrií představuje zásadní přístup při zkoumání struktury a funkce proteinových komplexů. Optimalizace křížovacích činidel a fragmentačních režimů významně ovlivňuje počet a kvalitu detekovaných křížově vázaných peptidů, což je klíčové pro aplikace v strukturní proteomice, vývoji léčiv i kvalitativní kontrole biotechnologických výrobků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkonnost čtyř homobifunkčních aminoskupin reaktivních crosslinkerů – dvou neštěpitel­ných (DSS, BS3) a dvou MS-štěpitelných (DSSO, BuUrBu) – při analýze křížově vázaných peptidů z rekombinantního BSA a z celulárního lyzátu E. coli. Hodnoceny byly různé fragmentační techniky (CID, ETD, EThcD) v režimech MS2 a MS3 na vysoce rozlišovacích Orbitrap přístrojích.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation a LC-MS podmínky:

• Křížování BSA a E. coli lyzátu v 50 mM HEPES pH 8, molární poměr činidlo/protein 20×.
• Redukce, alkylace, tryptická digesce, frakcionace na CX sloupci a desalting C18.
• RP-HPLC (Dionex UltiMate 3000, EASY-Spray 50 cm × 75 μm) 4–40 % gradientu.
• MS analýza na Orbitrap Fusion Lumos a Q Exactive HF v režimech MS2 (CID, ETD, EThcD) a MS2–MS3.

Data processing:

• Proteome Discoverer 2.2 s node XlinkX 2.0 a SEQUEST HT, 1 % FDR.
• Statické modifikace: +57.021 Da na Cys, proměnné: oxidace Met, adukty Lys dle crosslinkeru.
• Lineární peptide search pro MS3 skeny.

Hlavní výsledky a diskuse

• MS-štěpitelné crosslinkery DSSO a BuUrBu v kombinaci s MS2–MS3/EThcD umožnily identifikovat >40 křížově vázaných BSA peptidů oproti <20 v klasickém MS2 CID.
• U E. coli lyzátu přinesl režim MS2–MS3/EThcD nejvyšší počet identifikací napříč fragmentačními módy.
• Neštěpitelné DSS a BS3 vykazovaly dobrou odezvu v režimech CID/HCD/EThcD, ale nižší výtěžnost oproti štěpitelným crosslinkerům při MS3.
• Fragmentační energie EThcD ovlivnila intenzitu charakteristických crosslinkových iontů a tím selektivitu XlinkX filtrace.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný workflow spojující MS-štěpitelné reagencie s MS3/EThcD fragmentací výrazně zlepšuje pokrytí křížových vazeb, což usnadňuje mapování proteinových interakcí v komplexních vzorcích. To je přínosné pro výzkum virových komplexů, mapování interaktomu a validaci biotechnologických produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových štěpitelných crosslinkerů s vyšší selektivitou a odlišnými fragmentačními vzorci.
• Integrace státního vyhledávání crosslinkovaných sítí do strojového učení pro automatizované přiřazení a modelování struktury komplexů.
• Aplikace ve studiu živých buněk (in vivo XL-MS) a v kombinaci s cryo-EM či XR difrakcí pro hybridní strukturní biologie.

Závěr

Studie potvrdila, že pro detailní charakterizaci křížově vázaných peptidů je klíčové použití MS-štěpitelných crosslinkerů (např. DSSO, BuUrBu) ve spojení s režimem MS2–MS3/EThcD. Takový přístup významně zvyšuje počet identifikovaných vazebních míst i v komplexních biologických vzorcích.

Reference

1. Kao A. et al. Mol. Cell Proteomics. 2011;10(1):M110.002212.
2. Müller MQ. et al. Anal. Chem. 2010;82(16):6958–6968.
3. Liu F. et al. Nat. Methods. 2015;12(12):1179–1184.