LC separation optimization for XL-MS Analysis

Význam tématu

Crosslinking hmotnostní spektrometrie (XL-MS) je stále významnějším nástrojem pro studium prostorové struktury proteinů a jejich vzájemných interakcí v komplexních biologických vzorcích. Optimalizace kapalinové chromatografie je klíčová pro zvýšení citlivosti a selektivity analýzy navázaných peptidů, které jsou zpravidla ve velmi nízké koncentraci a o vysoké složitosti.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo porovnat výkon různých reverzních fází pro separaci crosslinkovaných peptidů při využití přístrojů Thermo Scientific Orbitrap Ascend a Thermo Scientific Astral. Dále byla vyvinuta nová MS2-MS3 metoda pro zlepšení přesnosti identifikace peptidů upravených novým heterobifunkčním crosslinkerem DizSEC.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky

• Crosslinkery: DizSEC, DSSO a DSBU aplikované na standardní proteiny a E. coli lyzát.
• Snížené vzorky digesce byly doplněny do tryptického Hela digestu.

Kapalinová chromatografie

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Neo.
• Porovnávané kolony: EASY-Spray PepMap RSLC C18, µPAC Neo, IonOpticks Aurora Ultimate.
• Gradient 6–50 % organiky (0,1 % FA) v době 60 min při průtoku 300 nL/min.

Hmotnostní spektrometrie

• Orbitrap Ascend a Orbitrap Astral ve DDA režimu.
• Pro DizSEC vyvinut MS2-MS3 režim s optimalizovanými parametry (rozlišení, injekční čas, NCE a top-speed).

Data-analysis

• Proteome Discoverer 3.0 s uzlem XlinkX pro crosslinky a SEQUEST HT pro monolinky/looplinky.
• Scout v1.4.14 pro komparativní analýzu.
• FDR 1 % na úrovni CSM a crosslinků.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání kolony ukázalo:

• PepMap přináší nejvyšší počet identifikovaných crosslinků a nejširší pokrytí vazeb.
• µPAC a Aurora detekují více HeLa proteinů, ale méně crosslinkovaných peptidů.
• Aurora vykazuje výrazný carry-over (2,5 %) ve srovnání s PepMap (1 %) a µPAC (0,5 %).

MS2-MS3 metoda pro DizSEC vedla k významnému snížení falešně pozitivních identifikací při zachování citlivosti.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované LC-MS workflow umožňuje spolehlivější mapování interakcí proteinů, podporuje studium komplexních biologických systémů a je vhodné pro QA/QC aplikace v biologické a farmaceutické analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj materiálů kolony s vyšším tlakovým limitem a menšími částicemi.
• Integrace ultrarychlých gradientů pro zvýšení propustnosti laboratoří.
• Rozšíření metodiky na další heterobifunkční a fotoreaktivní crosslinkery.
• Využití AI-řízené analýzy spektrogramů za účelem rychlejšího vyhodnocení XL-MS dat.

Závěr

Veřejná komparace kolony PepMap, µPAC a Aurora potvrdila, že výběr vhodného separačního materiálu zásadně ovlivňuje výsledky XL-MS analýzy. Nová MS2-MS3 metoda pro crosslinker DizSEC zvyšuje přesnost identifikace a otevírá cestu k širšímu využití tohoto reagenta v strukturální biologii.

Reference

• Faustino AM, Sharma P, Manriquez-Sandoval E, Yadav D, Fried SD. Progress toward Proteome-Wide Photo-Cross-Linking to Enable Residue-Level Visualization of Protein Structures and Networks In Vivo. Anal Chem. 2023 Jul 18;95(28):10670-10685.
• Milan Avila Clasen, Ruwolt M, Kurt LU, Gozzo FC, Wang S, Chen T, Carvalho PC, Lima DB, Liu F. Proteome-scale recombinant standards and a robust high-speed search engine to advance cross-linking MS-based interactomics. bioRxiv 2023.11.30.569448.