Quantification of ethyl glucuronide and ethyl sulfate in human urine by LC-HRAM(MS) for clinical research

Význam tématu

EtG a EtS jsou klíčoví biomarkery nedávné konzumace alkoholu, detekovatelné v moči až do 80 hodin po požití. Spolehlivá a citlivá kvantifikace těchto metabolitů je zásadní v klinickém výzkumu, toxikologii a QA/QC laboratořích, kde pomáhá objektivně ověřovat abstinenci, sledovat léčebné programy nebo vyšetřovat případy zneužití alkoholu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo implementovat a validovat kvantitativní metodu pro stanovení EtG a EtS v lidské moči pomocí vysoko­rozlišující hmotnostní spektrometrie (HRAM) na přístroji Q Exactive Plus v kombinaci s Vanquish Duo UHPLC. Metoda využívá režimy FullMS a PRM pro dosažení optimální selektivity, citlivosti a specifity.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific™ Vanquish™ Duo, kanál pro přímou injekci
• MS: Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap s HESI ve negativním módu
• Set pro přípravu vzorků: ClinMass® LC-MS/MS Complete Kit pro EtG a EtS v moči (RECIPE Chemicals + Instruments)
• Software: Thermo Scientific™ TraceFinder™ 5.1

Použitá metodika

Vzorek 50 µL moči byl zředěn 1 000 µL dilučního roztoku s interními standardy (d5-EtG, d5-EtS) a injektován objemem 15 µL. Chromatografické dělení probíhalo na analytické koloně dodané v kitu za 6 min gradientu (flow 0,2–0,7 mL/min, T=40 °C). Detekce probíhala v režimech FullMS (rozlišení 70 000) a PRM (rozlišení 17 500) s parametry: vaporizer 460 °C, kapilára 350 °C, spray voltage –2 500 V.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah: EtG 81,7–9 368 ng/mL, EtS 29,1–4 953 ng/mL.
• LLOQ: FullMS/PRM 4,08 ng/mL pro EtG, 14,6 ng/mL pro EtS.
• Bias kalibrace: vždy v intervalu ±15 % (±20 % pro nejnižší bod).
• Žádné carry-over: v blanku po nejvyšší kalibraci nebyly detekovány signály.
• Trueness vs. certifikované QC: bias –5,3 % až +11,3 %.
• Precision: intra-denní CV <6,3 % (FullMS), <3,3 % (PRM); mezidenní CV <10 % (FullMS), <5,1 % (PRM).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje vysokou selektivitu a citlivost díky HRAM Orbitrapu při rychlé a jednoduché přípravě vzorků. Je vhodná pro klinické studie, toxikologii a rutinní QA/QC testování účinně potvrzující abstinenci či monitoring konzumace alkoholu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace vzorkové přípravy a integrace online SPE pro vyšší throughput.
• Rozšíření panelu analýz o další alkoholové metabolity či drogy.
• Využití pokročilé datové analýzy a machine learning pro zpracování HRAM dat.
• Implementace v rozsáhlých screeningových programech a forenzní praxi.

Závěr

Navržená metoda kombinuje jednoduchou přípravu vzorku s vysoce výkonnou UHPLC-HRAM MS analýzou, která splňuje požadavky na citlivost, selektivitu a robustnost v klinickém výzkumu a rutinním testování EtG a EtS v lidské moči.

Reference

• RECIPE Chemicals + Instruments GmbH: ClinMass LC-MS/MS Complete Kit pro EtG a EtS v moči.
• Arvecon GmbH: certifikované QC materiály GTFCh ETG.
• Thermo Fisher Scientific: Vanquish Duo UHPLC, Q Exactive Plus MS a TraceFinder 5.1.