Ultrafast confirmation and quantitation of alcohol metabolite markers using the EVOQ Elite TQ coupled to the Elute UHPLC

Význam tématu

Detekce metabolitů alkoholu, zejména ethyl glucuronide (EtG) a ethyl sulfate (EtS), je klíčová pro spolehlivé sledování konzumace alkoholu v klinických, forenzních i kontrolních aplikacích. Jejich detekční okno v moči až 3–5 dní překonává přímé stanovení etanolu, což umožňuje ověřovat abstinenci či podávání alkoholu i po vyprchání krevních hladin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit rychlou a spolehlivou metodu pro současnou kvantifikaci EtG a EtS v moči, využívající novou UHPLC soustavu Bruker Elute spojenou s triplekvadruoplem EVOQ Elite. Studie zahrnuje validaci linearity, přesnosti, opakovatelnosti a aplikaci na standardizované round robin vzorky i reálné vzorky po konzumaci alkoholu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moče byly připraveny jednoduchou precipitací proteinů metanolem, přičemž do 100 µl moče bylo přidáno 20 µl isotopově značených interních standardů (EtG-d5, EtS-d5) a 250 µl metanolu. Po centrifugaci se supernatant odpařil a rehydratoval v 0,1 % kyselině mravenčí.

• UHPLC: Bruker Elute s kolonkou Restek Ultra Biphenyl (2,1×100 mm, 3 µm), mobilní fáze voda/methanol s 2 mM formiátem amonným a 0,1 % kyselinou mravenčí, gradient 2–80 % B za 1 min, průtok 400 µl/min, teplota 40 °C, objem injekce 10 µl.
• Hmotnostní spektrometrie: EVOQ Elite triple Kvadrupol se zdrojem VIP H-ESI v negativním módu (4000 V), srážecí plyn argon 1,5 mTorr, teplota 300–350 °C, MRM přechody optimalizované pro EtG, EtS a jejich d5 náhražky.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje výborné linearity (r2 ≥ 0,9997 pro EtG, ≥ 0,9998 pro EtS) v rozsazích 80–9621 ng/ml (EtG) a 27–4732 ng/ml (EtS). Bias nepřekročil ±8 % a opakovatelnost (RSD) byla ≤ 2,8 %. Round robin vzorky z GTFCh byly kvantifikovány v přijatelné akceptančním rozmezí s přesností do ±25 % pro extrémní koncentrace. Reálné vzorky odebrané 3 h po požití alkoholu obsahovaly koncentrace nad kalibrační rozsah (~19 000 ng/ml EtG, ~9 000 ng/ml EtS), po 24 h byly analyty detekovatelné v jednotkách až stovkách ng/ml. Chromatografický tvar vrcholů vykázal šířku FWHM pouze 3–4 s, což potvrzuje vysokou separační rychlost a účinnost.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje potvrzenou kvantifikaci EtG a EtS během tříminutové analýzy, což výrazně zvyšuje denní kapacitu laboratoře. Spolehlivě rozlišuje nízké i vysoké koncentrace, eliminuje vliv bakteriální degradace a falz-pozitiv z antiseptik. Hodí se pro klinickou toxikologii, forenzní testování i QA/QC v průmyslových aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další automatizace přípravy vzorků a plná integrace do LIMS systémů pro bezobslužný provoz. Rozvoj multiplexních metod pro souběžné stanovení dalších etanolových markerů, miniaturizace a přechod na ultrarychlé vysokotlaké systémy slibují ještě vyšší propustnost. Dále se otevírá prostor pro portable MS či adaptaci na otrasové biosenzory pro rychlou detekci v terénu.

Závěr

Prezentovaná tříminutová UHPLC-MS/MS metoda s Bruker Elute a EVOQ Elite poskytuje robustní, přesnou a vysoce citlivou kvantifikaci EtG a EtS v moči. Vysoká linearita, preciznost a rychlost analýzy ji předurčují pro široké uplatnění v klinické a forenzní praxi.