Expanding the Antibody-Oligo Conjugate (AOC) Characterization Toolbox: Part 2- Denaturing and Non-denaturing Analysis of siRNA Payload

Význam tématu

Antibody-oligonucleotide conjugáty (AOC) představují perspektivní třídu cílených terapeutik, jež kombinují specifickou biologickou aktivitu monoklonálních protilátek s regulační kapacitou siRNA. Precizní charakterizace volné siRNA a jejího linker-funkcionalizovaného derivátu před konjugací je klíčová pro zajištění kvality a efektivity finálního léčiva.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na porovnání denaturačních a nondenaturačních metod pro analýzu siRNA budujících bloků AOC při použití hydrofobní interakční chromatografie (HILIC-MS) a ion-párové RP-LC-MS (IPRP-MS). Cílem je ověřit, zda lze oba přístupy provozovat na jednom LC-MS systému a identifikovat klíčové parametry separace a detekce.

Použitá metodika

Vzorky volné siCOL1a1 siRNA a MCC-siCOL1a1 linkerované siRNA byly připraveny při koncentraci 5 µM v odpovídajících mobilních fázích pro HILIC a IPRP. HILIC-MS separace se prováděla na BEH Amide koloně při 35 °C (nondenaturace) a 90 °C (denaturace). IPRP-MS využila BEH C18 kolonu při 80 °C, ionizační režim ESI v negativním módu a vysokomolekulární rozsah (400–7000 m/z). Data se zpracovávala v aplikaci INTACT Mass a CONFIRM Sequence v rámci waters_connect platformy.

Použitá instrumentace

• BioAccord LC-MS System s ACQUITY Premier UPLC TUV detektorem
• ACQUITY Premier System a ACQUITY RDa Mass Detector
• ACQUITY Premier Glycoprotein BEH Amide Column 300 Å, 1.7 µm, 2.1×50 mm
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 Column 130 Å, 1.7 µm, 2.1×50 mm

Hlavní výsledky a diskuse

Denaturační HILIC-MS při 90 °C účinně rozpojila siRNA duplex na jednotlivé řetězce, zatímco při 35 °C zůstával duplex intaktní. Analýza ukázala monoisotopické hmotnosti volné siCOL1a1 (14 665,21 Da) a siCOL1a1-MCC (+219,09 Da) s přesností <10 ppm. IPRP-MS potvrdila ortogonální rozlišení sense a antisense řetězců a lokalizaci linkeru na 3′ konci sense řetězce prostřednictvím fragmentačního mapování (CONFIRM Sequence). Mimořádně citlivé sledování hydrolyzovaných linkerů (+18 Da) umožňuje optimalizaci stechiometrie v dalším kroku konjugace.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost provádět denaturační i nondenaturační analýzu siRNA na jednom LC-MS systému
• Redukce používání toxických ion-párových činidel díky HILIC-MS
• Rychlá metoda přechodu mezi analýzou oligonukleotidů a proteinů bez rozsáhlého čištění
• Integrovaná informatiká platforma urychluje vývojové workflow a podporuje regulační připravenost

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření HILIC-MS k analýze dalších typů oligonukleotidů a jejich modifikací, využití vyspělé dekonvoluční softwarové analýzy pro komplexní směsi AOC a integrace s technikami vysokého rozlišení (UHPLC-HRMS). Další optimalizace kolonek a mobilních fází podpoří automatizaci a vysokoprůtokové screeningové aplikace.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace denaturační a nondenaturační HILIC-MS s IPRP-MS na jednom BioAccord systému poskytuje komplexní charakterizaci komponent siRNA pro AOC. Tento přístup zvyšuje efektivitu, snižuje riziko kontaminace a zlepšuje stoprocentní sledovatelnost během vývoje konjugovaných terapeutik.

Reference

1. Finny A. et al. Waters Application Note 720008456, 2024.
2. Yogendrarajah P. et al. LCGC North America 41(2), 2023.
3. Doneanu C. et al. Waters Application Note 720007546, 2022.
4. Shion H. et al. Waters Application Note 720007212, 2021.
5. Brandenburg C. et al. WP8010, Waters-Wyatt White Paper, 2024.
6. Gilar M. et al. J Chrom A 1733, 465285, 2024.