Comprehensive LC-MS Analytical Assays for Antibody-Oligonucleotide Conjugate (AOC) and siRNA Linker-Payload Characterization

Význam tématu

Antibody-oligonucleotide konjugáty (AOCs) reprezentují inovativní třídu bioterapeutik, která spojuje cílené vlastnosti monoklonálních protilátek s biologickou aktivitou oligonukleotidů. Jejich přesné charakterizování je klíčové pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a konzistence výroby. Pokročilé LC-MS přístupy umožňují detailní stanovení poměru oligonukleotid–protilátka (OAR), substruktury linkerů a integrity oligonukleotidů i protilátek.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zavést a optimalizovat několik ortogonálních LC-MS metod na platformě BioAccord pro komplexní analýzu AOCs a siRNA konstrukcí. Studie rozvinula pět samostatných metod, které poskytují informace o masách, rozložení konjugátů a lokalizaci vazebných míst. Porovnány byly denaturující i nenaturované režimy, včetně reverzní fáze, SEC, SCX, HILIC a ion-pair RP.

Použitá instrumentace

• LC-MS systém BioAccord s rozšířeným hmotnostním rozsahem (m/z 400–9000)
• ACQUITY Premier BEH C4 kolona (1,7 µm, 2,1×50 mm)
• ACQUITY Protein BEH SEC 200 Å kolona (1,7 µm, 2,1×150 mm)
• BioResolve SCX mAb kolona (3 µm, 2,1×100 mm)
• ACQUITY Glycoprotein BEH Amide HILIC kolona (1,7 µm, 2,1×50 mm)
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 kolona (1,7 µm, 2,1×50 mm)
• IonHance Ammonium Acetate a CX-MS pufry
• Softwary UNIFI App a INTACT Mass App v1.9 na platformě waters_connect

Použitá metodika

Pro volnou sIgG protilátku byla použita denaturující RP-MS a nenaturovaná SEC-MS. AOCs byly charakterizovány nenaturovanou SCX-MS a SEC-MS pro OAR stanovení. Oligonukleotidy (siRNA) byly potvrzeny pomocí denaturujícího a nenaturovaného HILIC-MS a ion-pair RP-MS. Automatická kalibrace OAR byla zajištěna INTACT Mass App během zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Metody dosáhly hmotnostního rozdílu do 15 ppm vůči teoretickým hodnotám pro volnou protilátku i AOC vzorky. Nenaturovaná SEC-MS a SCX-MS spolehlivě rozlišily konjugáty s jedním i dvěma linker-payloady (OAR 1 a 2). HILIC-MS ukázala posun retenční doby a potvrzení vazby linkeru na sense strand siRNA. IPRP-MS poskytla detailní spektrální rozlišení jednotlivých řetězců siRNA.

Přínosy a praktické využití metody

Provedené ortogonální přístupy zaručují robustní a rychlou analýzu OAR a distribuce AOCs v rámci vývoje i výrobního procesu. Metody jsou implementovatelné od raných výzkumných fází až po validované QA/QC platformy. Automatizace výpočtu OAR a integrované reportování zkracují čas analýzy a minimalizují riziko chyb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací na další typy navázaných terapeutik, včetně multifunkčních konjugátů a různé chemie linkerů. Integrace s MS/MS detekcí a vysokým rozlišením v kombinaci s AI-based dekonvolučními algoritmy přinese hlubší vhled do heterogenity vzorků. Propojování LC-MS dat s chromatografiemi MALS a AEX-MALS umožní komplexní profilování molekulových vlastností.

Závěr

Pět ortogonálních LC-MS metod na BioAccord systému poskytuje komplexní profilování AOC a siRNA konjugátů. Kombinace denaturujících a nenaturovaných režimů, spolu s automatizovanými aplikacemi pro výpočet OAR, představuje efektivní a reprodukovatelné řešení pro vývoj a výrobu bioterapeutik.

Reference

1. Dovgan I et al. Antibody-Oligonucleotide Conjugates as Therapeutic, Imaging, and Detection Agents. Bioconjugate Chem. 2019;30:2483-2501.
2. Jiao J et al. Overcoming limitations and advancing the therapeutic potential of antibody-oligonucleotide conjugates (AOCs): Current status and future perspectives. Pharmacol Res. 2024;209:107469.
3. Shion H et al. Analysis of Antibody siRNA Conjugate Using BioAccord System. Waters Application Note 720007212. 2021.
4. Ippoliti S et al. Online IEX-MS of mAb Charge Variants Using a BioResolve SCX mAb Column… Waters Application Note 720006672EN. 2019.
5. Yogendrarajah P et al. Analysis of siRNA with Denaturing and Non-Denaturing Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography Methods. LCGC NA. 2023;41(2).
6. Finny A et al. Reproducible Hydrophilic Interaction Chromatography for Denaturing and Non-Denaturing Analyses of Oligonucleotides Using GTxResolve Premier BEH Amide Columns. Waters App Note 720008456. 2024.
7. Gilar M et al. Impact of mobile and stationary phases on siRNA duplex stability in liquid chromatography. J Chrom A. 2024;1733:465285.
8. Doneanu C et al. LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities Using the BioAccord System with ACQUITY Premier. Waters App Note 720007546. 2022.
9. Ippoliti S et al. BioAccord LC-MS System Enhancements for Improved Native MS Analysis. Waters App Note 720008813EN. 2025.
10. Ippoliti S et al. The INTACT Mass Application in waters_connect Platform Streamlines ADC DAR and Drug Distribution Analysis. Waters App Note 720008818EN. 2025.
11. Brandenburg C, Liu H, Kenrick S. WP8010: Determination of Multiple Quality Attributes of Antibody-Oligonucleotide Conjugate with SEC-MALS and AEX-MALS. Waters-Wyatt White Paper. 2024.