Expanding the Antibody-Oligo Conjugate (AOC) Characterization Toolbox: Part 3- Partial and Complete AOC Conjugation Site Determination

Význam tématu

Antibody-oligonucleotide conjugáty (AOC) spojují cílenou distribuci protilátek s terapeutickým efektem oligonukleotidu. Jejich vznik představuje příslib pro přesnější imunoterapie a onkologické aplikace. Klíčovým úkolem výzkumu je spolehlivá charakterizace místa navázání nukleotidu na protilátku, což je technicky náročné kvůli odlišným chemickým vlastnostem proteinové a nukleotidové složky. Rozvoj metod pro lokalizaci a kvantifikaci těchto vazeb je nezbytný pro zajištění kvality a účinnosti nových bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem této aplikace je rozšířit analytickou toolbox pro určování částečných i kompletních míst konjugace AOC. Studie navazuje na předchozí části zaměřené na stanovení celkové oligonukleotidové zátěže (OAR) pomocí SEC-MALS a siRNA komponent. Třetí část se soustředí na částečnou lokalizaci v podjednotkové úrovni a úplnou lokalizaci pomocí peptidové mapy s fragmentací.

Použitá metodika

• Enzymatické štěpení protilátky FabRICATOR™ na podjednotky, následované SCX-MS a SEC-MS analýzou pro částečnou lokalizaci.
• Předúprava AOC vzorku pomocí nucleoside digestion mix pro odstranění většiny oligonukleotidové kostry.
• Standardní protéomická workflow: denaturace, redukce, alkylace, tryptická digest se RapiZyme™ Trypsin a RPLC-MS.
• Analýza fragmentace peptidů (MSE a DDA režimy) na Xevo™ G3 QToF pro potvrzení míst konjugace.

Použitá instrumentace

• BioAccord™ LC-MS System a ACQUITY™ Premier System
• Xevo™ G3 QToF Mass Spectrometer, ACQUITY RDa™ Detector
• Kolony: Protein BEH™ SEC 200 Å, BioResolve™ SCX mAb, Peptide CSH™ C18
• UNIFI™ Application s waters_connect™ platformou pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

SCX-MS a SEC-MS analýzy subjednotek prokázaly, že konjugace siRNA probíhá nad kloubním (hinge) místem protilátky, což se projevilo změnami ve struktuře (Fd′+LC) a absencí konjugace v Fc doméně. Peptidové mapování po odstranění oligonukleotidu identifikovalo modifikované cysteiny v oblasti závěsu (např. Cys222). Fragmentační data potvrdila přesné pozice konjugace a umožnila relativní kvantifikaci (Sample 1: 10–17 %, Sample 2: 18–33 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přenosná workflow integruje existující peptide mapping nástroje a softwarové platformy.
• Možnost částečné lokalizace konjugace v nativních podmínkách a úplné potvrzení na peptidové úrovni.
• Podpora vývoje AOC bioterapeutik, optimalizace výrobních procesů a zajištění regulačních požadavků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávají se další zlepšení citlivosti SCX/SEC-MS metod a integrace nových enzymů pro specifické štěpení. Automatizace vzorkové přípravy a pokročilé softwarové algoritmy pro detekci konjugovaných peptidů vedou k rychlejší farmaceutické validaci. Rozšíření aplikací na různé typy konjugátů otevírá nové možnosti v cílené léčbě.

Závěr

Popsaná metodika nabízí robustní a univerzální řešení pro lokalizaci a relativní kvantifikaci míst konjugace oligonukleotidů na protilátkách. Kombinace subjednotkové analýzy a peptidového mapování s fragmentací překonává výzvy spojené s rozdílnou chemickou náturou komponent. Implementace do stávajících platforem usnadní bioterapeutický výzkum a vývoj AOC.

Reference

1. Dovgan I., Koniev O., Kolodych S., Wagner A. Antibody–Oligonucleotide Conjugates as Therapeutic, Imaging, and Detection Agents. Bioconjugate Chem. 30, 2483–2501 (2019).
2. Jiao J., Qian Y., Lv Y., Wei W., Long Y., Guo X., Buerliesi A., Ye J., Han H., Li J., Zhu Y., Zhang W. Overcoming limitations and advancing the therapeutic potential of antibody-oligonucleotide conjugates: Current status and future perspectives. Pharmacological Research. 209, 107469 (2024).
3. Ippoliti S., Schmudlach A., Lauber M.A., Yu Y.Q. Online IEX-MS of mAb Charge Variants Using a BioResolve SCX mAb Column. Waters Application Note 720006672EN (2019).
4. Brandenburg C., Liu H., Kenrick S. Determination of Multiple Quality Attributes of Antibody-Oligonucleotide Conjugate with SEC-MALS and AEX-MALS. White Paper WP8010 (2024).