Method Development for Preparative Purification of Long Oligonucleotides

Význam tématu

Purifikace dlouhých oligonukleotidů hraje klíčovou roli při vývoji terapeutických nukleových kyselin. Přísné požadavky na čistotu jsou nezbytné pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léků. Optimalizace chromatografických podmínek umožňuje oddělit cílovou sekvenci od vedlejších produktů syntézy a degradačních produktů.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na systematické testování různých stacionárních fází a iontových činidel pro preparativní ip-reverzní fázi LC s cílem purifikovat 60mer oligonukleotid modifikovaný 2′-O-methyl a 2′-hydroxyl skupinami. Klíčovým cílem bylo dosáhnout vysoké selektivity a reprodukovatelnosti metody pro laboratorní škálu.

Použitá instrumentace

• Analytická separace: Thermo Scientific UltiMate 3000 s Diode ARRAY detektorem (260 nm).
• Preparativní systém: Waters LC Prep AutoPurification s UV/Vis detektorem (280 nm).
• Přípravné kolony: XBridge Premier Oligonucleotide BEH C18 OBD Prep Columns (300 Å, 2.5 µm a 5 µm).

Metodika

Optimalizace probíhala ve dvou krocích: nejprve mikroškálové testy na kolónách 4.6×100 mm při 60 °C s použitím 100 mM TEAA a 100 mM HAA v ACN vodných mobilech. Gradienty byly nastaveny tak, aby maximalizovaly rozlišení cílového oligonukleotidu od souběžných fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

• TEAA i HAA poskytly adekvátní retenci, HAA však vykázalo vyšší rozlišení pro plnohodnotný 60mer.
• Preparativní škálování na 10×100 mm kolony: 2.5 µm částice dosáhly 70 % čistoty při 4 mg výtěžku (4 mL/min, 3000 psi), 5 µm kolona nabídla 62 % čistotu při 5 mL výtěžku (8 mL/min, 3000 psi).
• MaxPeak HPS povrchová úprava minimalizovala nespecifickou absorpci a zlepšila recoveri.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje přímou škálovatelnost z analytické na preparativní úroveň a vyznačuje se reprodukovatelnou čistotou i výtěžností. Zavedení inertních povrchů prodlužuje životnost kolony a minimalizuje ztráty vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje aplikaci alternativních iontových činidel, optimalizaci rychlejších gradientů pro vyšší propustnost a rozšíření na delší sekvence (70–100mer). Potenciál spočívá v automatizaci a integraci s hromadnými destilačními systémy pro industriální produkci.

Závěr

Systémový přístup k vývoji IP-RP LC metody pro dlouhé oligonukleotidy vedl k optimalizaci stacionární fáze, iontového činidla a chromatografického hardware. Vybraná kombinace XBridge Premier BEH C18 OBD a hexylammonium acetátu zaručila vysoké rozlišení i reprodukovatelnost při škálování.

Reference

• Mitigation of analyte loss on metal surfaces in liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2021.
• Procedure for the Synthesis and Deprotection of Synthetic RNA. Glen Research, Report 19.22.
• Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography Method for Analysis of mRNA Poly(A) Tail Heterogeneity. Waters Application Note, 2023.
• HPLC Purification of Long Synthetic Oligonucleotides. Waters Application Note, 2003.
• Effect of ion-pairing reagent hydrophobicity on liquid chromatography and mass spectrometry analysis of oligonucleotides. Elsevier, 2022.