Increasing the Productivity of Oligonucleotide Purification through Column Scaling and Method Optimization

Význam tématu

Purifikace syntetických oligonukleotidů je klíčová pro vývoj geneticky orientovaných léčiv i analytické metody v genové terapii a molekulární diagnostice. Efektivní a škálovatelná chromatografická separace umožňuje získat dostatečné množství vysoce čistého materiálu pro preklinické i klinické studie, zároveň snižuje náklady a expoziční rizika spojená s použitím toxických rozpouštědel.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na optimalizaci procesu izolace 20-mer oligonukleotidu od analytické až po preparativní úroveň. Cílem je nahradit drahé a potenciálně nebezpečné ion-pairing činidlo HFIP (hexafluoroisopropanol) cenově výhodnějším a bezpečnějším systémem založeným na triethylammonium acetátu (TEAA), a zároveň demonstrovat přímé škálování metody z UPLC™ na širokoobjemovou HPLC kolonu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje tři kroky:

• Analytická separace na kolóně ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 (2,1×100 mm, 1,7 µm) s mobilní fází TEA/HFIP pro srovnání parametrů.
• Vývoj analytické HPLC metody na kolóně XBridge Oligonucleotide BEH C18 (4,6×50 mm, 2,5 µm) s mobilní fází 100 mM TEAA pH 7,0 a acetonitrilem.
• Škálování na preparativní kolónu XBridge Oligonucleotide BEH C18 OBD Prep (30×50 mm, 2,5 µm) využitím Waters Autopurification System (3767 Sample Manager/fraction collector, SFO, PDA/TUV detektor, SQD2 single quadrupole MS, ACQUITY ISM make-up pump).

Hlavní výsledky a diskuse

Teplotní snížení z 60 °C na 25 °C při TEAA mobilní fázi udrželo dostatečnou separační účinnost bez sekundárních struktur krátkých oligonukleotidů. Převedení analytické metody na preparativní kolónu s ID 30 mm umožnilo zpracovat ~410 µg na injekci, dosáhnout jednorázového výtěru ~85 % s čistotou >96 %. Zvýšením hmotnostního zatížení až na 25 mg vzrostl produktivní výtěžek až na stovky mg/hod, přičemž pozvolné rozšíření píků může být kompenzováno cílenou frakcionací okraje a apexu píku.

Optimalizace gradientu a navýšení průtoku ve fázi regenerace zkrátily dobu cyklu o ~25 %, čímž se produktivita zvýšila až na 100 mg čistého oligonukleotidu za hodinu.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění HFIP snižuje provozní náklady a expoziční riziko, mobilní fáze TEAA zůstává snadno odpařitelná.
• Škálovatelnost z analytické na preparativní kolónu usnadňuje rychlé zavádění metod ve výzkumných i výrobních laboratořích.
• Optimalizované parametry průtoku, gradientu a čištění kolony vedou k vysoké produktivitě a reprodukovatelnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další zvyšování produktivity lze dosáhnout použitím širokoobjemových kolón s ID 50 mm a offline regenerací kolony pomocí přepínacích ventilů a další pumpy. Integrace MS-řízené frakcionace zvýší selektivitu. Rozvoj nových ion-pairing činidel a sorbentů s nižší retenční variabilitou přispěje k vyšší účinnosti purifikace delších oligonukleotidů a modifikovaných nukleotidů.

Závěr

Popisovaný přístup demonstruje úspěšné převedení HFIP-TEA analytické UPLC metody na cenově dostupný a bezpečný TEAA-based preparativní proces. Díky optimalizaci kolony, gradientu i průtoků je možné dosáhnout >95% čistoty a produktivity až 100 mg/hod ve standardních laboratořích bez nutnosti vysoce specializovaného vybavení.

Reference

• Patrik D. McDonald et al., Optimum Bed Density [OBD™] columns: Enabling Technology for Laboratory-Scale Isolation and Purification, Waters Application Note (720001939).
• Gilar M. et al., Best Practices for Oligonucleotide Analysis Using Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography, Waters Application Note (720006948).
• Gilar M. et al., HPLC and UPLC column for Analysis of Oligonucleotides, Waters Application Note (720002376).
• Lefebvre P. et al., Evaluating the Tools for Improving Purification Productivity, Waters Application Note (720001696, 2007).