Rapid and Sensitive Detection of dsRNA Contaminants in mRNA Using the GTxResolve™ 250Å Slalom Chromatography Column

Význam tématu

mRNA terapie představují průlomovou platformu pro vývoj vakcín, proteinové náhrady a imunoterapii nádorů. Klíčovým problémem při výrobě mRNA in vitro transkripcí je tvorba nežádoucích dvojvláknových RNA (dsRNA), které mohou vyvolávat imunitní odpověď a ovlivnit bezpečnost a účinnost terapeutika.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je představit rychlou a vysoce citlivou dvoukrokovou metodu pro detekci dsRNA kontaminant v mRNA. První krok využívá selektivní enzymatické štěpení jednovláknové RNA (ssRNA) enzymem RapiZyme Cusativin. Druhý krok pak využívá slalom chromatografii na sloupci GTxResolve 250 Å pro oddělení zachované dsRNA od produktů degradace ssRNA.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava modelové dsRNA: PCR amplifikace 3 kb úseku cas9 genu s T7 promotorem, in vitro transkripce, purifikace a annealing dvou komplementárních řetězců.
• Enzymatické očištění: Incubace 100 ng ssRNA nebo dsRNA s 200 U RapiZyme Cusativin v pufru amonného acetátu pH 9,0 při 30 °C po dobu 1 h, následné inaktivace při 75 °C.
• Slalom chromatografie: Isokratické rozdělení v 1X TAE (pH 8,3) při průtoku 1,3 mL/min, teplota kolony 40 °C, detekce rychlostí 40 Hz.

Instrumentace:

• Waters ACQUITY Premier System (Quaternary Solvent Manager, TUV detector, FTN Sample Manager)
• GTxResolve 250 Å Slalom Chromatography Column, MaxPeak Premier Technology, 2,5 µm, 4,6×300 mm
• RapiZyme Cusativin (Waters) pro selektivní degradaci ssRNA
• Monarch RNA Cleanup Kit, TURBO DNase I pro purifikaci RNA
• Agarózová elektroforéza: 0,6 % agaróza v TAE se SYBR Gold

Hlavní výsledky a diskuse

• Slalom chromatografie rozlišila ssRNA a dsRNA na základě odlišného eluce, přičemž dsRNA vykázala odolnost vůči RapiZyme Cusativin.
• Detekční limit dosáhl 10 ng dsRNA, což znamená více než 40násobné zlepšení oproti agarózové elektroforéze (400 ng).
• Metoda trvá méně než 6 minut oproti >60 min tradiční agarózové gelu.
• Sloupce ze dvou různých výrobních šarží prokázaly výbornou reprodukovatelnost (%RSD retence a plochy nízké jednotky až nízké desítky procent).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a vysoce citlivé stanovení dsRNA v mRNA přípravcích.
• Nízké množství vzorku (10 ng) umožňuje ekonomické využití cenných materiálů.
• Jednoduchá dvoukroková workflow vhodná pro rutinní QC a vývoj procesu produkce mRNA terapeutik.
• Vysoká reprodukovatelnost podporuje standardizaci testování podle regulačních požadavků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na různé délky a konformace mRNA.
• Optimalizace parametrů chromatografie (průtok, viskozita solventu, teplota) pro další zvýšení rozlišení.
• Integrace s online detekcí a automatizovanými platformami pro vysokokapacitní screening.
• Studium interference sekundárních struktur mRNA s metodou slalom chromatografie.

Závěr

Dvoustupňová kombinace selektivního enzymatického štěpení ssRNA a slalom chromatografie na sloupci GTxResolve 250 Å poskytuje robustní, rychlou a vysoce citlivou metodu pro detekci dsRNA kontaminant v mRNA. Tento přístup významně zvyšuje citlivost, snižuje požadavky na vzorek a je plně reprodukovatelný mezi různými šaržemi sloupců, čímž přispívá k bezpečnosti a kvalitě mRNA terapeutik.

Reference

1. Kang DD, Li H, Dong Y (2023) Advancements of in vitro transcribed mRNA (IVT mRNA) to enable translation into the clinics. Adv Drug Deliv Rev 199:114961. https://doi.org/10.1016/j.addr.2023.114961
2. Gholamalipour Y et al (2018) 3′ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character—RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Res 46:9253–9263. https://doi.org/10.1093/nar/gky796
3. Liu X et al (2025) Research progress on immune mechanism and control strategy of dsRNA impurities in mRNA vaccine. Expert Rev Vaccines 24(1):457–469. https://doi.org/10.1080/14760584.2025.2510335
4. Liu J et al (2024) An improved method for the detection of double-stranded RNA suitable for quality control of mRNA vaccines. Protein Cell 15(11):791–795. https://doi.org/10.1093/procel/pwae043
5. Karikó K et al (2011) Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res 39(21):e142. https://doi.org/10.1093/nar/gkr695
6. Clark NE et al (2024) An immuno-northern technique to measure the size of dsRNA byproducts in in vitro transcribed RNA. Electrophoresis 45:1546–1554. https://doi.org/10.1002/elps.202400036
7. Gritti F (2025) Retention mechanism in slalom chromatography: Perspectives on the characterization of large DNA and RNA biopolymers in cell and gene therapy. J Chrom A 1743:465691. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2025.465691
8. Vaishnav J et al (2025) A New Alternative to Gel Electrophoresis: Higher Resolution and Faster Analysis of Large Nucleic Acids by Rigorously Designed GTxResolve 250Å Slalom Columns. Waters Application Note 720008921
9. Vaishnav J et al (2025) Plasmid Topology and Digest Analysis Using a GTxResolve 250 Å Slalom Chromatography Column. Waters Application Note 720008954
10. Addepalli B et al (2024) Tunable Digestions of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications. Waters Application Note 720008539