A New Alternative to Gel Electrophoresis: Higher Resolution and Faster Analysis of Large Nucleic Acids by Rigorously Designed GTxResolveTM 250 Å Slalom Columns

Význam tématu

Analýza velkých nukleových kyselin je klíčová pro vývoj genové a buněčné terapie i pro QA/QC v biotechnologickém průmyslu. Tradiční agarózová a kapilární gelová elektroforéza jsou časově náročné a často nabízejí omezené rozlišení při velikostech nad 3 kbp. Slalom chromatografie představuje rychlou alternativu s vysokým rozlišením a minimálními sekundárními interakcemi.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí nově navržené Waters GTxResolve 250 Å Slalom Columns pro ultrarychlou separaci velkých dsDNA fragmentů. Cílem je porovnat výkon s agarózovou elektroforézou, ověřit reprodukovatelnost mezi kolónami a šaržemi, sledovat obnovitelnost signálu a životnost až 400 injekcí.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza byla prováděna na ACQUITY UPLC I-Class Bio System s detektorem TUV (260 nm). Použita byla kolóna GTxResolve 250 Å Slalom Column, 2,5 μm, 4,6×300 mm. Mobilní fáze: 1× TAE buffer (40 mM Tris-acetát, 1 mM EDTA, pH 8,3). Průtok 1,4 mL/min, teplota kolóny 40 °C, vzorek: lyofilizovaný dsDNA 23K Ladder (2–23 kbp), objem injekce 1 μL. Pro test životnosti se vkládala každých 10 injekcí 10 μL 1 M spermidinu a provádělo čištění průtoku.

Hlavní výsledky a diskuse

Slalom chromatografie prokázala 4,5× lepší rozlišení mezi 9,4 a 23 kbp fragmenty oproti agarózové gelu, separace trvala <6 min. Reprodukovatelnost mezi pěti kolónami a třemi šaržemi pro retenční časy a rozlišení měla %RSD <1 %. Obnova signálu A260 byla 91–95 %, což naznačuje minimální nespecifické adsorpce. Po 400 injekcích zůstalo rozlišení i tlak téměř beze změn (ΔR <1,5 %, Δtlak –0,8 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Analýza fragmentů >3 kbp s vysokým rozlišením za <6 min
• Minimální nespecifické adsorpce a vysoká obnova vzorku
• Vynikající reprodukovatelnost mezi kolónami a šaržemi
• Robustní provoz životnost až 400 injekcí bez výrazné ztráty výkonu
• Možnost kvantifikace a sběru frakcí pro další analýzu

Budoucí trendy a možnosti využití

Slalom chromatografie může dále rozšířit aplikace v QA/QC genových terapií, např. pro impurity profiling mRNA a dsRNA. Kombinace s SEC módem umožní oddělení menších nečistot. Budoucí vývoj může vést k miniaturizaci, paralelním analytickým protokolům a integraci do automatizovaných CGT procesů.

Závěr

Waters GTxResolve 250 Å Slalom Columns nabízejí rychlou, vysoce reprodukovatelnou a robustní alternativu k gelové elektroforéze pro analýzu velkých nukleových kyselin. Metoda urychluje genové a buněčné terapií workflow a zlepšuje kvalitu dat v krátkém čase.

Reference

• Wang YS, Kumari M et al. mRNA-based vaccines and therapeutics: an in-depth survey of current and upcoming clinical applications. J Biomed Sci. 2023;30:84.
• Du J, Fan Z et al. The rise of mRNA therapeutic vaccines. RSC Pharm. 2025;2:235–256.
• Boyes B, Walker D, McGeer P. Separation of large DNA restriction fragments on a size exclusion column by a non-ideal mechanism. Anal Biochem. 1988;170:127–134.
• Hirabayashi J, Kasai K. Slalom chromatography: size-dependent separation of DNA molecules by a hydrodynamic phenomenon. Biochemistry. 1990;29:9515–9521.
• Gritti F, Wyndham K. Retention mechanism in combined hydrodynamic and slalom chromatography for analyzing large nucleic acid biopolymers relevant to cell and gene therapies. J Chromatogr A. 2024;1730:465075.
• Gritti F. Ultra-high pressure slalom chromatography: Application to the characterization of large DNA and RNA samples relevant in cell and gene therapy. J Chromatogr A. 2024;1738:465487.
• Gritti F. Retention mechanism in slalom chromatography: Perspectives on the characterization of large DNA and RNA biopolymers in cell and gene therapy. J Chromatogr A. 2025;1743:465691.