End-To-End Workflow Solutions for Short Nucleic Acids and mRNA Analysis

Význam tématu

Rychlý rozvoj krátkých syntetických oligonukleotidů a mRNA má klíčový význam v oblasti genové terapie, vakcín a diagnostiky. Zajištění přesné kvality těchto molekul, zahrnující velikost, čistotu, tepelnou stabilitu, 5′ capping a délku poly(A) konce, je nezbytné pro spolehlivost výzkumu i výrobních procesů.

Cíle a přehled článku

Text představuje komplexní end-to-end workflow řešení pro analýzu krátkých nukleových kyselin a mRNA od fáze výzkumu až po QC a produkci. Popisuje tři hlavní přístupy:

• Workflow 1: analýza krátkých RNA a ssDNA pomocí kapilární elektroforézy (CE).
• Workflow 2: kontrola čistoty a velikosti mRNA prostřednictvím CE, kapilárního systému TapeStation a UV-Vis spektroskopie.
• Workflow 3: stanovení efektivity 5′ cappingu a délky 3′ poly(A) konce pomocí LC/Q-TOF MS.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow 1 – kapilární elektroforéza krátkých nukleových kyselin:

• Agilent Fragment Analyzer (sady pro malé RNA do 200 nt).
• Agilent Oligo Pro II systém (analýza ssDNA/ssRNA do 60 mer, 12/24/96 kapilár).
• Detekce UV absorpcí bez barviv; software ProSize a Oligo Pro II Software.

Workflow 2 – mRNA čistota a sizing:

• Agilent Fragment Analyzer a 4200 TapeStation pro sizing plazmidu, IVT produktu, délku poly(A) a čistotu.
• UV-Vis spektrofotometr Cary 3500 (1,5 mm svazek, až 7 vzorků, Peltierova regulace).
• BioTek Synergy H1 multimode mikrotitrátor (UV/Vis 230–999 nm) a Take3 mikroobjemová deska pro vysokopropustné měření (96/384 well) s možností fluorescenčního kvantifikování.
• Software Cary UV Workstation a Gen6 pro správu dat.

Workflow 3 – LC/Q-TOF MS pro 5′ capping a 3′ poly(A):

• LC systém 1290 Infinity II Bio LC se sloupcem AdvanceBio Oligonucleotide nebo Poroshell 120 HPH-C18 pro capping workflow.
• 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro přesné stanovení hmotností fragmentů po RNáze-H nebo T1 štěpení.
• Magnetické oligo-dT kuličky pro obohacení poly(A) fragmentů.
• Software MassHunter BioConfirm pro analýzu posttranskripčních modifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

CE systémy umožňují vysoké rozlišení a automatizovaný monitoring krátkých RNA a ssDNA, přičemž vysoce přesná měření usnadňují optimalizaci protokolů izolace a purifikace. UV-Vis spektroskopie doplňuje sizing o rychlou detekci kontaminantů a stanovení koncentrace. Mikrotitrátorové platformy zvyšují propustnost a automatizaci kvantifikace. LC/Q-TOF workflow poskytuje detailní pohled na účinnost cappingu a distribuci poly(A) délek, což je klíčové pro biologickou aktivitu mRNA.

Přínosy a praktické využití metody

Robustní QC aplikace zajišťují konzistentní kvalitu bioterapeutik a vakcín, umožňují rychlou validaci výrobních šarží a redukují náklady díky optimalizaci procesů. Integrované platformy podporují přechod mezi výzkumem a výrobou bez nutnosti rozsáhlých manuálních zásahů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj vysokopropustných a plně automatizovaných systémů s výraznější integrací LC-MS a AI-řízené analýzy dat. Rozšíření multiplexních assay a real-time monitoringu povede k rychlejšímu vývoji personalizovaných terapií.

Závěr

Popsané workflowy nabízejí komplexní řešení pro kvalitativní i kvantitativní analýzu krátkých nukleových kyselin a mRNA. Kombinace CE, UV-Vis a LC/Q-TOF MS zaručuje spolehlivou kontrolu kritických parametrů a podporuje efektivní přechod od výzkumu k průmyslové výrobě.

Reference

• Comparison of Small RNA Analysis using the Agilent Bioanalyzer and Agilent Fragment Analyzer Systems. Agilent Technologies technical overview, 5994-4860EN, 2022.
• Performance Characteristics of the Agilent Oligo Pro II System. Agilent Technologies technical overview, 5994-3667EN, 2021.
• Nucleic Acid Analysis for Sample Quality Assessment Using the Agilent Fragment Analyzer Systems. Agilent Technologies application compendium, 5994-2813EN, 2022.
• Best Practices for Analysis of IVT mRNA Using the Agilent Fragment Analyzer Systems. Agilent Technologies technical overview, 5994-6568EN, 2023.
• Best Practices for Analysis of In Vitro Transcribed (IVT) mRNA Using the Agilent Fragment Analyzer Systems. Agilent Technologies technical overview, 5994-5927EN, 2023.
• Quality Control in IVT RNA Workflow using Agilent TapeStation Systems. Agilent Technologies technical overview, 5994-4882EN, 2022.
• Rapid Analysis of mRNA 5' Capping with High Resolution LC/MS. Agilent Technologies application note, 5991-3984EN, 2021.
• Analysis of mRNA Poly(A) Sequence Variants by High-Resolution LC/MS. Agilent Technologies application note, 5994-3005EN, 2021.