Large-Panel Targeted Proteomics with Single-Cell-Equivalent Sensitivity Using Nanoflow 6495D LC/TQ

Význam tématu

Analýza proteinů ve stopových množstvích, včetně úrovně jediné buňky, je zásadní pro odhalení variací v exprese proteinů a post-translačních modifikacích, které se mohou ztrácet ve studiích hromadných vzorků. Cílová proteomika založená na nanoflow LC/TQ nabízí vysokou citlivost, specificitu a reprodukovatelnost, což je klíčové pro výzkum heterogenních biologických systémů, klinickou diagnostiku a objevování biomarkerů.

Cíle a přehled studie

Tato aplikace představuje vývoj a validaci metody dynamického MRM (dMRM) pro kvantifikaci 1 000 proteinů lidské buněčné linie K562 z množství odpovídajících jednotlivým buňkám. Integrovaná platforma kombinuje Evosep One LC, Newomics UniESI ion source a Agilent 6495D triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr, přičemž klade důraz na citlivost, specificitu a vysokou průchodnost analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Evosep One LC systém s IonOpticks Aurora Elite XT kolonkou (15 cm × 75 μm id, 1,7 μm C18; 200 nL/min, 50 °C; Whisper Zoom 20 SPD metoda).
• Newomics UniESI ion source pro Agilent MS (pozitivní ionizace, 200 °C, 11 L/min, 1 600 V).
• Agilent 6495D triple kvadrupólový LC/MS s MassHunter acquisition software (pre-release beta), dMRM až 10 000 tranzicí, max. 500 současných MRMs, cyklový čas 1 400 ms.
• Agilent AssayMAP Bravo pro automatizované nakládání 50 ng proteinového extraktu K562 na Evotipy.
• Příprava vzorků: sériová ředění (64 ng až 31,25 pg on-column) v protein LoBind tubách.
• Vývoj metody v Skyline: tvorba RT prediktoru z 33 endogenních peptidů, import 1 000 cílových proteinů, multi-parametrické filtry (dotp > 0,75, peak found ratio > 0,75, shape correlation ≥ 0,9), volitelné ladění kolizní energie.

Hlavní výsledky a diskuse

• Finalizovaná dMRM metoda obsahuje 7 942 tranzicí pro 1 000 peptidů (8 fragmentů na peptid) s maximálně 500 současnými MRMs.
• Vysoká shoda retenčních časů mezi dMRM (6495D) a DDA (LC/Q-TOF): 98,5 % konzistence, potvrzující vysokou specifitu detekce.
• Reprodukovatelnost: medián CV oblasti píku 7,5 %, 96,2 % peptidů s CV < 20 % napříč celým gradientem.
• Kvantifikace: 578 proteinů s R² > 0,99, 256 s 0,90 < R² ≤ 0,99; 10 % proteinů detekováno při 31,25 pg, 33,6 % při 250 pg a 47,8 % při 500 pg on-column.
• Příkladné peptidy LLLPGELAK (histon) a LVVPATQCGSLIGK (PCBP1) prokázaly vynikající linearitu, citlivost a konzistentní fragmentační vzorce i na nejnižších úrovních.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení nákladů a zjednodušení vývoje metody bez potřeby stabilně značených peptidů.
• Vysoká citlivost a specificita pro omezené a cenné vzorky, vhodné pro single-cell proteomiku a biomarkerové studie.
• Možnost analyzovat 1 000 proteinů v jednom běhu s vysokou průchodností, ideální pro screening a translační výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na další biologické vzorky s tvorbou specifických RT knihoven.
• Integrace AI-řízeného vývoje metod a automatizace pro adaptaci na různé proteomy.
• Aplikace v klinických laboratořích pro rutinní analýzu nízkomnožstevních vzorků a personalizovanou medicínu.

Závěr

Integrovaná nanoflow LC/TQ platforma poskytuje robustní, vysoce citlivé a průchodné řešení pro velkopanelovou cílovou proteomiku na úrovni jediné buňky. Nabízí spolehlivé kvantifikace s nízkým CV a vysokou specifitou, čímž podporuje jak základní výzkum, tak průmyslové a klinické aplikace.

Reference

• Triple Quadrupole LC/MS Peptide Quantitation with Skyline Workflow Guide B.08.02, Agilent Technologies, publikace 5990-9887EN, 2018.
• The Agilent Nanodapter for Discovery Proteomics Using Nanoflow LC/MS, Agilent Technologies, publikace 5991-8174EN, 2017.
• Desiere F. et al. The PeptideAtlas Project. Nucleic Acids Research 2006, 34, D655–D658.
• Lam H. et al. Building Consensus Spectral Libraries for Peptide Identification in Proteomics. Nature Methods 2008, 5(10), 873–875.
• NIST Libraries of Peptide Tandem Mass Spectra. National Institute of Standards and Technology, DOI:10.18434/T4ZK5S.
• Zolg D. P. et al. Building Proteome Tools Based on a Complete Synthetic Human Proteome. Nature Methods 2017, 14(3), 259–262.
• A Rapid and Economical Workflow for Protein Biomarker Discovery Using Agilent 6495D TQ LC/MS System, Agilent poster ASMS 2024 ThP076.
• Lefkovits I. Quantitative Proteomics of Lymphocytes. Comp. Funct. Genomics 2003, 4(5), 531–536.
• Kulak N. A. et al. Minimal, Encapsulated Proteomic-Sample Processing Applied to Copy-Number Estimation in Eukaryotic Cells. Nature Methods 2014, 11(3), 319–324.
• Virant-Klun I. et al. Identification of Maturation-Specific Proteins by Single-Cell Proteomics of Human Oocytes. Mol. Cell Proteomics 2016, 15(8), 2616–2627.