Quantification of Host Cell Protein Impurities Using the Agilent 1290 Infinity II LC Coupled with the 6495B Triple Quadrupole LC/MS System

Význam tématu

Hostitelské proteiny (HCP) představují nízkoúrovňové impurity v rekombinantních bioterapeuticích, které mohou ovlivnit jejich bezpečnost a účinnost. Regulace a kontrola HCP je proto klíčová v souladu s požadavky regulačních orgánů. Tradiční metoda ELISA postrádá dostatečnou specifitu a pokrytí pro identifikaci jednotlivých HCP. LC/MS technologie s cílenou kvantifikací pomocí MRM představují citlivou alternativu, avšak vyžadují řešení problematiky koeluce vzácných peptidů v matici terapeutického proteinu.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo předvést robustní workflow pro kvantifikaci HCP na úrovních sub-ppm pomocí LC/MS přístrojů Agilent. Studie demonstrovala kompletní postup od automatizované přípravy vzorku až po optimalizaci MRM metod a vyhodnocení dat. Klíčové kroky zahrnují:

• Automatizovaná denaturace, redukce, alkylace a trypsinová digestace na platformě AssayMAP Bravo
• Separaci peptidů na Agilent 1290 Infinity II LC systému s obrácenou fází C18
• Detekci a akvizici v režimu dynamic MRM na Agilent 6495B Triple Quadrupole LC/MS
• Vývoj a optimalizaci metod v Skyline se zabudovaným Agilent Automation tool
• Kvantitativní vyhodnocení v Agilent MassHunter Quantitative Analysis

Použitá metodika a instrumentace

• AssayMAP Bravo systém pro plně automatizovanou přípravu vzorků
• Agilent 1290 Infinity II LC s vysokorychlostním pumpou, multisamplerem a termostatem kolony
• Reverzní C18 kolona s nabitým povrchem, gradient od 3 do 90 % acetonitrilu ve formiátovém pufru, tok 0,5 mL/min a teplota 60 °C
• Agilent 6495B Triple Quadrupole s Dual Jet Stream ESI
• Dynamic MRM režim se 500 ms cyklem, dostupy dle optimalizovaných kolizních energií
• Skyline Automation tool a MassHunter Quantitative Analysis pro tvorbu metod a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající linearitu (R2 > 0,998) pro tři testované peptidy při rozsahu od nízkých amolových úrovní až po stovky fmol/µg. LLOQ dosahovalo 0,24 ppm pro SUMO1, 0,70 ppm pro SYHC a 0,13 ppm pro endogenní peptid S100-A11. Relativní odchylky (RSD) pod 18 % a přesnost 83–112 % potvrdily reprodukovatelnost. Automatizace přípravy vzorků minimalizovala variabilitu a zvýšila propustnost. Při absolutní kvantifikaci s využitím těžkých peptidů byla pozorována podhodnocená koncentrace (~50 %), což zdůrazňuje nutnost korekce efektů ztrát během přípravy a digesce.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow spojuje vysokou citlivost, reprodukovatelnost a automatizaci, čímž umožňuje rutinní kontrolu HCP v biopharmaceutické výrobě. Krátká doba analýzy (9 minut) a integrované nástroje pro optimalizaci metod zkracují čas vývoje a validace. Metoda je vhodná pro QA/QC laboratoře zaměřené na sledování produktové čistoty a regulatorní soulady.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu HCP markerů díky cílené MRM analýze
• Integrace vysokorozlišovací MS pro potvrzení identit peptidů
• Další automatizace a miniaturizace příprav vzorků pro zvýšení throughput
• Implementace AI nástrojů pro zrychlené zpracování a interpretaci dat

Závěr

Představený postup spojuje automatizovanou přípravu vzorků, rychlou chromatografii a dynamické MRM metody pro přesnou a citlivou kvantifikaci HCP. Výsledky potvrzují schopnost detekovat a kvantifikovat nízkoúrovňové HCP impurity s vysokou reprodukovatelností, což je klíčové pro vývoj a výrobní kontrolu bioterapeutik.

Reference

1. ICH Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.
2. Host Cell Protein Analysis Using Agilent AssayMAP Bravo and 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF, Agilent Technologies, 5991-9300EN.
3. Agilent Triple Quadrupole LC/MS Peptide Quantitation with Skyline, Agilent Technologies, 5990-9887EN.
4. Separation of Peptide Standards Using Formic Acid as a Mobile Phase Additive, Agilent Technologies, 5991-8597EN.
5. Gerber SA et al. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003.
6. Oeckl P, Steinacker P, Otto M. Comparison of Internal Standard Approaches for SRM Analysis of Alpha-Synuclein in Cerebrospinal Fluid. J. Proteome Res. 2018.
7. Brun V et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 2007.
8. Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform, Agilent Technologies, 5991-2957EN.
9. Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform, Agilent Technologies, 5991-4872EN.