Comprehensive Protein Quantification in Plasma Using the Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS System

Význam tématu

Multiplexní kvantifikace proteinů v lidské plazmě pomocí MRM LC/MS nabízí citlivé a přesné stanovení biomarkerů, což je zásadní pro klinické a výzkumné aplikace. Nové přístrojové funkce a automatizace značně zkracují dobu optimalizace metod.

Cíle a přehled studie / článku

Prezentovat výkon systému Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS v kombinaci s MassHunter Workstation 12.1 a automatizovanou integrační Skyline-Agilent SWARM autotune workflow pro komplexní kvantifikaci multiplexu proteinů v lidské plazmě a porovnání s předchůdcem.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II bio LC System (bio pumpa, multisampler s termostatem, multicolumn thermostat)
• Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS System se 4. generací iFunnel
• MassHunter Workstation software verze 12.1
• Skyline software (MacCoss lab, University of Washington)

Použitá metodika

• Denaturace plazmy TFE, redukce DTT, alkylace iodoacetamidem, tryptická digestace při 37 °C
• SIS (stable isotope-labeled standard) peptidy spikované v koncentracích 1,25 amol/µl až 50 fmol/µl
• Analýza standardních křivek pětinásobnými replikáty; LC gradient 0–80 % ACN, 0,4 ml/min
• MRM akvizice: až 303 současných přechodů, submilisekundová doba dwell (0,5 ms), doba akvizičního cyklu ~832 ms

Hlavní výsledky a diskuse

• Signální zesílení: medián 2,4× vyšší MS signál oproti předchůdci, bez nárůstu šumu
• Citlivost: LLOQ 1,25 amol/µl pro vybrané peptidy při RSD <20 % a přesnosti 80–120 %
• Rozsah linearity: 1,25 amol/µl až 50 fmol/µl; R2 >0,99 pro vybrané analyty
• Reprodukovatelnost:
  • 303 MRMs, 0,5 ms dwell, 17 snímků na vrchol o šířce 0,25 min
  • %RSD signálu <20 % pro 79 cílových peptidů, <10 % pro 60 peptidů (20 replikátů)
  • %RSD retence <0,3 % u testovaných peptidů

Přínosy a praktické využití metody

Standardizovaná konfigurace a automatizovaný workflow zkracují čas potřebný k vývoji metod, umožňují vysokoproduktivní analýzu desítek až stovek proteinových biomarkerů v biologických vzorcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj umělé inteligence v autotuningu a reflexních workflow, rozšiřování panelů pro multiplexní targetované proteomické aplikace, integrace do klinických rutin a vývoj robustních high-throughput řešení.

Závěr

Systém Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS s MassHunter Workstation 12.1 a Skyline-Agilent SWARM autotune nabízí ultravysoce citlivou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci proteinových biomarkerů v plazmě s minimalizovanou potřebou manuální optimalizace.

Reference

1. Mohammed Y. et al. Absolute Quantitative Targeted Proteomics Assays for Plasma Proteins. Methods Mol. Biol. 2023, 2628, 439–473.
2. Gaither C. et al. Determination of the Concentration Range for 267 Proteins From 21 Lots of Commercial Human Plasma Using Highly Multiplexed Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry. Analyst 2020, 145(10), 3634–3644.
3. Skyline Workflow Guide B.08.02, Agilent Technologies, 2018, publication number 5990-9887EN.