Label-free DIA-based workflow for single-cell proteomic analysis on an Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer

Význam tématu

Single-cell proteomika představuje revoluční přístup k analýze proteomů jednotlivých buněk, umožňující odhalit heterogenitu v buněčných populacích a identifikovat unikátní funkční stavy. Zvýšená citlivost, dynamický rozsah a throughput jsou klíčové pro přenos této technologie do reálných experimentů v biomedicíně i průmyslu.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo optimalizovat gradienty a parametry hmotnostní spektrometrie pro label-free Data Independent Acquisition (DIA) na Orbitrap Exploris 480 a demonstrovat robustní workflow pro single-cell analýzu. Studie porovnává dva režimy throughput – 48 samples per day (SPD) a 82 SPD – na HeLa diluční sérii a skutečných buňkách připravených platformou CellenONE.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer s rozlišením Full MS 120k a DIA MS/MS 60k
• Vanquish Neo UHPLC system v režimu direct injection
• 25 cm Aurora Ultimate TS kolona (IonOpticks)
• FAIMS Pro interface (kompenzační napětí –50 V)
• CellenONE platforma pro izolaci a tryptickou digesti jednotlivých buněk
• Softwarové nástroje: Spectronaut 18 (Biognosys), ProteomeDiscoverer 3.1 s algoritmem Chimerys (MSAID)

Použitá metodika

Pro vývoj workflow byla připravena HeLa digest diluční série (50 pg–10 ng) v 0,015 % DDM a 0,1 % kyseliny mravenčí. Pro single-cell vzorky byly HeLa buňky jednotlivě roztříděny, redukovány, alkylovány a digesovány podle protokolu CellenONE. Byly navrženy dva gradienty: 14 min (48 SPD) a 24 min (82 SPD) s aktivními gradienty 11,2 a 19,5 min. Pracovní rozsah m/z byl omezen na 400–800 a FDR kontrolováno na 1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro dávky 250 pg HeLa digestu identifikováno rutinně >2 500 proteinových skupin a >10 000 peptidových sekvencí v triplicích.
• Režim 48 SPD vykazoval o ~25 % vyšší počet proteinů při vyšších dávkách oproti 82 SPD.
• Quantitativní přesnost: log2 poměry abundancí odpovídaly očekávaným hodnotám, koeficient variační (CV) peptide abundancí <15 % (kromě 50 pg, CV < 10 %).
• V single-cell experimentech s 48 SPD identifikováno >1 500 proteinových skupin a >5 000 peptidových sekvencí z jediné buňky s vysokou replikovatelnou overlap (většina sekvencí sdílená ve všech replikátech).

Přínosy a praktické využití metody

Tato optimalizovaná workflow nabízí kombinaci vysoké citlivosti a dostatečného throughput pro středně velké studie klinických a biologických vzorků. Direct injection a label-free DIA eliminují nutnost knihoven, což zkracuje dobu přípravy a zjednodušuje proces. Metoda je použitelná v laboratorních podmínkách QA/QC i ve výzkumných projektech mapujících buněčnou heterogenitu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vylepšení mohou zahrnovat širší m/z rozsah, rychlejší scanovací režimy a integraci umělé inteligence pro pokročilou analýzu dat. Rozšíření workflow na různé typy buněk a onkologické vzorky umožní lepší porozumění patofyziologii. Kombinace s kolektivním multiplexováním a paralelními oddělovacími technikami může dále zvýšit datový výtěžek.

Závěr

Byl vyvinut label-free DIA workflow na Orbitrap Exploris 480 umožňující robustní analýzu single-cell proteomu v režimech 48 SPD a 82 SPD. Metoda prokázala vysokou citlivost, replikovatelnost a kvantitativní přesnost na HeLa diluční sérii i reálných buňkách.