Deeper proteome coverage and faster throughput for low-input and single cell samples on the Orbitrap Ascend Tribrid mass spectrometer

Význam tématu

Rostoucí zájem o proteomiku jednotlivých buněk vyžaduje vysoce citlivé a rychlé přístupy ke zpracování velmi malých množství vzorků. Tyto metody jsou klíčové pro pochopení heterogenity biologických systémů na úrovni jednotlivých buněk.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit pokrytí proteomu a propustnost analýzy nízkých vstupních dávek a jednotlivých buněk na Orbitrap Ascend Tribrid masovém spektrometru při použití knihovně nezávislého režimu datově nezávislé akvizice (DIA).

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnovalo nanogramové a pikogramové dávky HeLa proteinové digesty. Separace probíhala na Vanquish Neo UHPLC s 22min gradientem při 0,2 µL/min a cyklem 25 minut. Spektrometrické parametry zahrnovaly FAIMS Pro rozhraní (CV –50), Orbitrap skenování při rozlišení 120 000, následné DIA skeny s izolací 40–50 m/z a kolizní energií 28 %.
Instrumentace:

• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC
• Orbitrap Ascend Tribrid masový spektrometr
• FAIMS Pro rozhraní
• EasySpray iontové zdroje
• Proteome Discoverer 3.1 s CHIMERYS algoritmem
• Spectronaut 18

Hlavní výsledky a diskuse

V knihovně nezávislém režimu bylo identifikováno více než 1200 proteinových skupin z 50 pg, více než 3200 skupin z 250 pg a přes 5500 skupin z 10 ng HeLa digestu. Projektově specifické DIA knihovny ze 5–10 ng vzorku zvýšily identifikace na více než 4800 proteinových skupin z 250 pg. Kvantitativní přesnost byla vysoká, s mediánem CV <8 % (bez knihovny) a <12 % (s knihovnou), pro 250 pg dokonce 5,2–7,4 %. Analýza jednotlivých buněk přinesla v průměru 3762 proteinových skupin, při rozšířeném vyhledávání až přes 4600.

Přínosy a praktické využití metody

Popisované řešení poskytuje vysokou citlivost, reprodukovatelnost a robustní propustnost pro nízkoinputové a single cell proteomické studie bez nutnosti rozsáhlé spektrální knihovny. Využití nachází v základním výzkumu, QA/QC a průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucího rozvoje se dočkáme integrací strojového učení pro predikci spekter, automatizací přípravy vzorků a rozšířením do multiomických projektů. Vyšší propustnost a hloubka pokrytí umožní rozsáhlé screeningy buněčných populací a dynamické sledování jejich změn.

Závěr

Orbitrap Ascend Tribrid ve spojení s FAIMS Pro a Vanquish Neo UHPLC nabízí výjimečnou citlivost, rychlost a kvantitativní přesnost pro analýzu nízkých dávek a jednotlivých buněk pomocí DIA bez externí knihovny.

Reference

Nebyly uvedeny