Bioanalytical HILIC LC-MS Compatibility Using the GTxResolve™ Premier Amide Column and OligoWorks™ SPE Sample Preparation Solution

Význam tématu

Hydrofobní a iontově párované metody RP-LC-MS jsou běžné pro analýzu oligonukleotidů, avšak HILIC nabírá na významu díky mobilním fázím bez iontových párů založeným na amonných pufrech. Tyto pufry jsou méně toxické, ekonomičtější a zlepšují kompatibilitu s bioanalytickými odběry po organické extrakci. Počáteční vysoký podíl organické fáze v HILIC chromatografii minimalizuje problémy s rozpustností oligonukleotidů a nespecifickou adsorpcí.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí použití OligoWorks SPE bioanalytického roztoku pro přípravu vzorků v kombinaci s HILIC LC-MS na kolóně GTxResolve Premier Amide. Hlavním cílem je ověřit kompatibilitu přípravku a optimalizovat objem injekce pro kvalitativní i kvantitativní analýzu oligonukleotidů a jejich konjugátů.

Použitá metodika

Rozlišené mobilní fáze pro HILIC obsahovaly 25 mM amonného acetátu pH 6,8 a acetonitril, pro srovnání IP-RP-LC pak 0,1 % DIPEA s 1 % HFIP ve vodě a 0,0375 % DIPEA s 0,75 % HFIP v acetonitrilu/vodě. Oligonukleotidové standardy byly připraveny ve vodě s RNázou a v eluátu OligoWorks SPE ředěném acetonitrilem. Injekční objemy se měnily v rozsahu 1–10 µl při 1:1 a 1:2 ředění eluátu.

Použitá instrumentace

• Kolóna GTxResolve Premier BEH Amide, 300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 50 mm
• ACQUITY UPLC I-Class PLUS System s Flow Through Needle Sample Manager
• ACQUITY Premier System s Fixed-Loop Sample Manager
• BioAccord vysokorozlišovací hmotnostní spektrometr s detektorem ACQUITY RDa
• TQ Absolute MS System

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání IP-RP-LC a HILIC ukázalo, že neomodifikované oligonukleotidy se v HILIC zadržují silněji díky polaritě, zatímco hydrofobní konjugáty vykazují nižší retenci. Optimalizace ředění 1:2 umožnila až 10 µl injekce bez deformace píku u raně eluujících vzorků. Částečná tlaková asistence a větší smyčka dále zlepšují toleranci objemu vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje analýzu oligonukleotidů bez toxických iontových párů, zjednodušuje přípravu biologických vzorků a nabízí širší rozsah objemu injekce. To přispívá k lepší citlivosti a opakovatelnosti v bioanalytickém výzkumu, kontrole kvality i farmakokinetice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace může zahrnovat integraci tlakově asistovaných vstřiků, širší použití na různé typy konjugátů a rozšíření na vysoce propustné klinické analýzy. Uplatnění nalezne také v multikomponentních biopolymerních studiích a v automatizovaných platformách pro farmaceutický vývoj.

Závěr

Studie potvrzuje, že kombinace OligoWorks SPE řešení a HILIC LC-MS na GTxResolve Premier Amide kolóně je efektivní pro analýzu oligonukleotidů s objemem injekce až 10 µl. Metoda poskytuje spolehlivá data s minimální úpravou gradientu a injekčních parametrů.