Improved Bioanalytical Extraction of Therapeutic Antisense Oligonucleotides, Including a Lipid Conjugated ASO From Liver and Brain Tissue Using the OligoWorks™ SPE Microplate Kit

Význam tématu

Oligonukleotidová terapie nabízí cílenou modulaci genové exprese při léčbě genetických onemocnění, nádorů a virových infekcí. Pro podporu farmakokinetických a metabolických studií je nezbytné spolehlivé stanovení koncentrace těchto molekul v komplexních tkáňových matricích. Vysoká variabilita chemických modifikací a vazba na proteiny kladou náročné požadavky na extrakční a čisticí postupy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a optimalizovat protokol pro extrakci terapeutických antisense oligonukleotidů, včetně lipidové konjugace, z jater a mozkové tkáně. Použita byla konvenční homogenizace s Proteinázou K a následná purifikace pomocí WAX smíšeného režimu SPE v 96-jamkové mikrodestilační destičce, aby se dosáhlo vysokých výtěžků a opakovatelnosti.

Použitá metodika

Vzorky 50 mg tkáně byly spikeovány směsí oligonukleotidů (GEM 91, GEM 132, lipidové ASO), přidány Tris-HCl pH 5,5 a acetonitril. Do směsi se přidaly reagencie z RapiZyme Digestion Module (GuHCl, TCEP, Proteináza K). Následovala homogenizace (Precellys), inkubace, odstředění (9 400 RCF, 30 min) a odběr supernatantu (100 µl) pro SPE.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class PLUS System s FTN
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 Column, 130 Å, 1,7 µm, 2,1×50 mm, teplota 55 °C
• Xevo TQ-Absolute Triple Quadrupole MS (kapilára 0,5 kV; desolvace 600 °C, 1 000 L/h; cone gas 150 L/h)
• Precellys homogenizátor s 2 ml lysovacími trubicemi

Hlavní výsledky a diskuse

Pro oba modelové ASO (GEM 91, GEM 132) i lipidové konjugáty byla dosažena extrakční účinnost ≥80 % při RSD ≤10 % a lineární kalibrace (R² ≥0,98 v játrech, ≥0,99 v mozku). U lipidového ASO úvod přídavku 1 % NP-40 Alternative zvýšil výtěžek z 80 % na 100 % (játra) a z 20 % na 100 % (mozek) za podmínky rozšířeného počtu SPE wash kroků.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a opakovatelnost stanovení oligonukleotidů v tkáňových matricích
• Minimální objem eluátu kompatibilní s přímou injekcí do LC-MS bez nutnosti koncentrace
• Krátké gradienty UPLC pro vysokou průchodnost analýzy
• Škálovatelnost do formátu 96 jamkových destiček pro rutiní DMPK laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření automatizace extrakce, zavedení stabilizovaných interních standardů pro kvantifikaci, adaptace metod pro nové chemické modifikace oligonukleotidů a integrace vysoce propustných technologií mikroextrakce. Důležitá je také optimalizace lysis kroků se šetrnějšími surfaktanty a rozvoj miniaturizovaných SPE formátů.

Závěr

Popisovaný protokol kombinující Proteinázu K s WAX smíšeným režimem SPE destičky OligoWorks poskytuje robustní a opakovatelnou metodu pro extrakci terapeutických antisense oligonukleotidů z jaterní a mozkové tkáně s výtěžky ≥80 % a RSD ≤10 %. Volitelný přídavek NP-40 Alternative umožňuje dokonalou extrakci silně hydrofobních lipidových konjugátů. Metoda je praktická, škálovatelná a podporuje vývoj i klinické aplikace oligonukleotidové terapie.

Reference

1. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.
2. Boehm M., Guldbrandtsen B. Non-ionic surfactants for solubilization and stabilization of proteins. Methods Enzymol. 1994;227:284–300.
3. Kleiner D.E., Lentz T. Optimizing the extraction of RNA from tissues. BioTechniques. 2000;29(1):186–189.
4. Gibson T.J. A Survey of Non-Ionic Surfactants. Trends Biochem Sci. 1995;20(8):338–340.
5. Roussel C. et al. Influence of lysis buffer composition on mass spectrometry-based proteomic analyses. J Proteomics. 2013;80:78–90.
6. Käll L. et al. Non-linear peptide ionization in nanoelectrospray mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 2007;6(4):555–565.
7. McLafferty F.W. et al. Matrix effects in mass spectrometry: A review. J Mass Spectrom. 2001;36(10):1013–1020.
8. Fent K. et al. Ecotoxicology of surfactants. Environ Sci Technol. 2006;40(7):2243–2250.
9. Baker C. et al. Surfactants and their effects on human health and the environment. Environ Health Perspect. 2017;125(6):064001.
10. Van Tran K., Trudeau M., Lauber M. High Oligonucleotide Recovery From Liver Tissue. Waters Application Note. 2024.