Improve the Productivity of Purification Workflows

Význam tématu

Preparativní HPLC je klíčová technika pro izolaci a purifikaci jednotlivých sloučenin z komplexních směsí. V aplikacích od přírodních extraktů přes syntetické peptidy až po farmaceutické meziprodukty je často selektivita UV detekce nedostatečná. Masová detekce přidává citlivost a selektivitu, umožňuje cílené sledování definovaných iontů a zajišťuje vysokou čistotu získaných frakcí.

Cíle a přehled článku

Článek představuje technický přehled využití detektoru Agilent InfinityLab Pro iQ Series Mass Detector integrovaného s OpenLab CDS pro masově řízené purifikační workflow. Popisuje vylepšené hardwarové a softwarové funkce zaměřené na zjednodušení nastavení metody, zvýšení produktivity a dosažení vyšší čistoty frakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Veškeré experimenty proběhly na sestavě Agilent 1290 Infinity II Preparative LC System:

• Preparativní binární pumpa (G7161B)
• Open-Bed sampler/collector (G7158B)
• Diode Array Detector WR (G7115A) s preparativní tokovou kyvetou
• Isokratická pumpa (G7110B)
• Kolonová komora (G7163B)
• MS Flow Modulator (G7170B) a Delay Coil Organizer (G9324A)
• Mass Detector InfinityLab Pro iQ Plus LC/MS (G6170A)
• Prep 100Å C18 kolona 10×50 mm, 5 µm (446905-802)
• Agilent OpenLab CDS v. 2.8 FR2

Mobilní fáze tvořil acetonitril Gradient Grade a voda z Milli-Q systému; pro MS makouf byl použit acetonitril pro LC/MS a kyselina mravenčí.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Definice cílových sloučenin a aduktů
S pomocí editoru OpenLab CDS lze zadat chemickou formuli nebo monoisotopickou hmotnost a vybrat očekávané adukty, polaritu a stav náboje. Software automaticky vypočítá m/z poměry a vytvoří kombinovaný SIM trigger, který spolehlivě aktivuje odběr frakcí bez nutnosti ručního ladění aduktů.

2. Vícenásobné náboje peptidů
U velkých molekul (peptidů, oligonukleotidů) lze do cíle přidat různé stavové náboje (+1 až +5). Součet všech SIM signálů zajišťuje robustní detekci, jak ukázala purifikace angiotensinu I, kde hlavní podíly nesly +2 a +3 ionty.

3. Exkluze nečistot pomocí NOT logiky
Nová logika kombinuje signály cílových iontů s výhradním (NOT) triggerem pro nežádoucí sloučeniny. Příklad s kofeinem a oranžovým barvivem prokázal, že oddálením odběru až po poklesu signálu exkluzního iontu se čistota kolekce zvýšila z 93 % na > 99 % bez druhého čištění.

4. Sekvenční přepsání parametrů (override columns)
OpenLab CDS umožňuje v sekvenci vzorků přepisovat prahy čtyř triggerů a tří skupin cílových mas. Uživatel tak bez úprav původní metody doladí nastavení pro každý vzorek a vše je zaznamenáno v datovém souboru pro auditovou stopu.

Přínosy a praktické využití metody

• Maximální selektivita odběru frakcí definovaná chemickou formulí a adukty
• Vysoká citlivost díky sledování specifických m/z signálů
• Eliminace kontaminace koelujících nečistot pomocí NOT triggeru
• Zvýšení produktivity díky automatizaci definice triggerů a flexibilitě přepisů v sekvenci
• Jednodušší validace a dokumentace purifikačních postupů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s pokročilou automatizací a robotickými systémy pro vysokou propustnost
• Využití strojového učení pro optimalizaci nastavení triggerů a rozpoznávání vzorkových profilů
• Rozšíření aplikací na čistění přirozených produktů, metabolomiky a klinických vzorků
• Zavádění ekologičtějších mobilních fází a udržitelných průtokových technik

Závěr

Masově řízená kolekce frakcí v Agilent OpenLab CDS spolu s detektorem InfinityLab Pro iQ výrazně zjednodušuje purifikační workflow. Definice cílových látek podle formule, podpora vícenásobných nábojů, NOT logika pro exkluzi nečistot a sekvenční přepis parametrů přinášejí vyšší produktivitu a čistotu frakcí. Tento přístup usnadňuje práci chromatografům a zkracuje dobu potřebnou pro dosažení požadované čistoty analytů.

Reference

1. Harness the Power of Pro. Agilent Technologies brochure, publication number 5994-8330EN, 2025.
2. Efficient Purification of Synthetic Peptides at High and Low pH. Agilent Technologies application note, publication number 5994-5311EN, 2022.