Discovery of a New Inhibitor for PFKFB2 Kinase Activity Through Mechanistic Studies

Význam tématu

Regulace glykolýzy prostřednictvím PFKFB2 je klíčová pro řízení energetického metabolismu v citlivých tkáních i nádorových buňkách. Cílené ovlivnění aktivity této kinázy otevírá nové možnosti léčby onemocnění spojených s dysregulovanou glukózou, jako jsou rakovina, diabetes nebo jaterní fibróza.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout robustní testovací platformu pro identifikaci malých molekul inhibujících PFKFB2 a ověřit ji v buňkových modelech. Kombinací AI-poháněného výběru sloučenin (AtomNet), enzymatických assay, analyzátoru Seahorse XFe24 a LC/Q-TOF LC/MS byly charakterizovány účinky kandidáta B2.

Použitá metodika

• Enzymatická PPi–PFK-vázaná kinetická metoda pro měření IC₅₀ inhibice PFKFB2 a PFKFB3.
• Glykolytický stress test na Seahorse XFe24: měření ECAR po sekvenční stimulaci glukózou, oligomycinem a 2-deoxyglukózou.
• Cílená metabolomika pomocí Agilent 6546 LC/Q-TOF s InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z kolonou.
• Analýza dat v MassHunter, vlastní PCDL databáze s METLIN, statistické vyhodnocení v MetaboAnalyst.

Použitá instrumentace

• Agilent Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer
• Agilent 1290 Infinity II LC se 6546 LC/Q-TOF detektorem
• Agilent BioTek Cytation 5 pro četnost buněk
• Agilent Captiva EMR–Lipid cartridge pro filtraci extraktů
• Bradford proteinová analýza pro normalizaci vzorků

Hlavní výsledky a diskuse

Kandidát B2 vykázal IC₅₀ ≈ 3,3 μM pro PFKFB2 a 11,9 μM pro PFKFB3. V analýze na Seahorse XFe24 došlo k významnému snížení bazální glykolýzy i maximální glykolytické kapacity v A-498 buňkách. LC/MS ukázala snížení F-1,6-BP, zvýšení poměru F-6-P/F-1,6-BP a útlum downstream intermediátů (G3P, 3-PGA, PEP), což potvrzuje inhibici kroku PFK-1.

Přínosy a praktické využití metody

Propojení funkčního měření extracelulárního acidifikačního toku a detailní metabolomiky umožňuje komplexní pohled na působení inhibitorů. Tento přístup může urychlit objevování a charakterizaci účinných modulátorů metabolických enzymů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Implementace nových verzí přístrojů (Seahorse XF Flex, Glycolytic Rate Assay, Revident LC/Q-TOF) a rozšíření na další PFKFB izoformy či jiné onemocnění. Vývoj AI-poháněných screeningových platforem a multi-omics analýz pro cílenou farmakologii.

Závěr

Kombinace Seahorse XFe24 a LC/Q-TOF analýzy umožnila identifikovat a validovat B2 jako nový inhibitor PFKFB2 a PFKFB3. Metodika představuje účinný nástroj pro výzkum metabolismu a objevování léčiv.

Reference

1. Rider MH et al. Biochem J. 2004, 381, 561–579.
2. Bartrons R et al. Front Oncol. 2018, 8, 331.
3. Okar DA et al. Trends Biochem Sci. 2001, 26, 30–35.
4. Jones BC et al. Cancer Metastasis Rev. 2022, 41, 447–458.
5. Kitamura K et al. J Biol Chem. 1988, 263, 16796–16801.
6. Xiao M et al. Ann Med. 2023, 55, 1278–1289.
7. Liu Q et al. Int J Mol Med. 2024, 54.
8. Griesel BA et al. FASEB J. 2021, 35, e21728.
9. Yi M et al. Mol Metab. 2019, 20, 1–13.
10. Atomwise AI platform. Sci Rep. 2024, 14, 7526.
11. Eyster C et al. PLoS One. 2025.
12. Yannell K et al. Agilent Technologies App Note. 2023.
13. Crochet RB et al. Proteins. 2017, 85, 117–124.