Illuminating the Cellular and Molecular Response to Drug Treatment by Combining Bioenergetic Measurements with LC/MS Omics

Význam tématu

Studium metabolických adaptací nádorových buněk je klíčové pro identifikaci nových terapeutických cílů a pochopení mechanismů účinku léčiv.
Kombinace bioenergetických měření in vitro s molekulárními přístupy LC/MS umožňuje komplexní pohled od buněčné k molekulární úrovni.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo prozkoumat metabolické změny v leukemických buňkách ošetřených inhibitory tyrozinkináz (AG-879, SU1498) pomocí Agilent Seahorse XF bioenergetiky a LC/Q-TOF metabolomiky a lipidomiky.
Studie sledovala akutní (2 h) a prodlouženou (18 h) inkubaci, charakterizovala mitochondriální funkce, tok ATP a profil nízkomolekulárních metabolitů i lipidů.

Použitá metodika a instrumentace

Bioenergetická měření provedl Agilent Seahorse XF Pro analyzátor: měření OCR, ECAR, glykoATP, mitoATP, protonového úniku a rezervoárové kapacity.
Pro buněčná počítání sloužil Agilent NovoCyte flow cytometr s NovoSampler Q.
Automatizované přípravy vzorků zajišťoval Agilent Bravo Metabolomics Sample Prep Platform s EMR–Lipid destičkami.
Molekulární analýzu provedl Agilent 1290 Infinity II Bio LC spojený s Agilent Revident LC/Q-TOF; software MassHunter Acquisition, Explorer, Lipid Annotator a Mass Profiler Professional.

Hlavní výsledky a diskuse

Seahorse XF analýza ukázala, že oba inhibitory vyvolávají mitochondriální odpojování protonu, přičemž SU1498 působí rychleji a AG-879 vykazuje pomalejší nástup.
Metabolomika odhalila pokles glykolytických meziproduktů (cukerné fosfáty) a výrazný nárůst pantothenové kyseliny u SU1498, dále akumulaci purinů (uridin, inosinu, hypoxanthinu, guaninu).
Lipidomika prokázala výrazné zvýšení triacylglycerolů (TG) zejména u SU1498 a selektivní obohacení fosfatidylinozitolů obsahujících PUFA, což naznačuje přeskupení lipidového metabolismu.
Data podporují hypotézu, že buňky ošetřené SU1498 kompenzují sníženou mitochondriální funkci aktivací anaplerotických drah, zatímco AG-879 potlačuje rezervoárovou kapacitu buněk.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrovaný workflow poskytuje ucelený obraz metabolismu od buněčných toků po molekulární profily.
• Možnost odhalit mechanismy účinku a off-target efekty kandidátních látek.
• Užitečné pro farmaceutický výzkum, QA/QC a průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření o kvalitativní 13C-flux analýzy pro sledování toků uhlíku.
• Využití dalších Seahorse kitů k určení závislosti na specifických substrátech.
• Komparativní studie zdravých PBMC jako kontrola nádorového metabolismu.
• Implementace strojového učení pro integraci vícero omických dat.
• Aplikace ve vývoji kombinovaných terapií zacílených na metabolismu nádorových buněk.

Závěr

Kombinace bioenergetických měření s LC/MS metabolomikou a lipidomikou umožnila odhalit nové metabolické přizpůsobení leukemických buněk po léčbě inhibitory tyrozinkináz.
Workflow je přenosný a lze jej aplikovat na další buněčné modely a látky pro komplexní studium mechanismů účinku.

Reference

1. Vander Heiden MG, Locasale JW, Cantley LC. Understanding the Warburg Effect: The Metabolic Requirements of Cell Proliferation. Science. 2009;324(5930):1029-33.
2. Kam Y, et al. Rapid Bioenergetic Functional Screening of Anticancer Drug Candidates. Agilent Technologies Application Note. 2023;5994-5651EN.
3. Van de Bittner GC, et al. Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples. Agilent Technologies Technical Overview. 2022;5994-5065EN.
4. Wang G, et al. Using the Agilent NovoCyte Flow Cytometer for Immune Suspension Cell Normalization in Agilent Seahorse XF Assays. Agilent Technologies Application Note. 2023;5994-6245EN.
5. Yannell K, et al. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent Technologies Application Note. 2023;5994-5628EN.
6. Huynh K, et al. Curated High-Throughput Method for Detailed Analysis of the Plasma Lipidome. Agilent Technologies Application Note. 2021;5994-3747EN.
7. Feith A, et al. Improved Metabolomic Analysis Using an Iron-Free Flow Path. Agilent Technologies Application Note. 2022;5994-4622EN.
8. Wattanavanitchakorn S, et al. 13C Glucose Qualitative Flux Analysis in HepG2 cells. Agilent Technologies Application Note. 2019;5994-0713EN.