Extracellular Flux Analysis and 13C Stable-Isotope Tracing Reveals Metabolic Changes in LPS-Stimulated Macrophages

Význam tématu

Macrofágy po stimulaci lipopolysacharidem (LPS) přecházejí k glykolytickému metabolismu, což je klíčové pro jejich imunologickou aktivaci. Kombinace fenotypové analýzy extracelulárního toku (OCR, ECAR) a stabilně izotopického trasování umožňuje sledovat metabolické dráhy v reálném čase a odhalit mechanismy buněčné energetiky.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje synergii mezi Agilent Seahorse XF technologií pro měření bioenergetického profilu a 13C trasováním s Agilent LC/Q-TOF pro cílenou analýzu metabolitového toku při stimulaci RAW 264.7 makrofágů LPS po dobu 4 hodin.

Použitá metodika

• Kultivace RAW 264.7 buněk se směsí 12C/13C glukózy a stimulace LPS (100 ng/mL, 4 h).
• Extrahování metabolitů pomocí acetonitrilu/methanolu/vody (40:40:20) při –20 °C a centrifugace.
• Měření OCR a ECAR s pomocí XF Cell Mito Stress Test.
• Chromatografická separace HILIC metodou (Poroshell 120 HILIC-Z).
• Statistická analýza: Studentův t-test (p < 0,05).

Použitá instrumentace

• Agilent Seahorse XFp Analyzer s kartridžemi XF Cell Mito Stress Test.
• Agilent 1290 Infinity II LC s InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z kolonkou.
• Agilent 6546 LC/Q-TOF (negativní ionizace, m/z 40–1000).
• Software: MassHunter VistaFlux, Profinder, Omix Premium, Pathways to PCDL.

Hlavní výsledky a diskuse

• Aktivace LPS vyvolala 100násobný nárůst uvolněného TNFα, potvrzující funkční odpověď buněk.
• Fenotypová analýza ukázala přechod k glykolýze (zvýšené ECAR, snížená mitochondriální respirace).
• 13C trasování odhalilo silné zařazení značky do glykolytických intermediátů a TCA cyklu, zejména nárůst tvorby itakoniové kyseliny.
• Potlačení reduktivní větve TCA cyklu a přesměrování uhlíku vedoucí k produkci itakoniové kyseliny bylo potvrzeno změnami izotopologové distribuce.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrace fenotypových a metabolomických dat umožňuje detailní charakterizaci bioenergetických adaptací buněk.
• Workflow lze aplikovat na různé buněčné typy a podmínky pro rychlou i hloubkovou analýzu metabolismu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další stabilní izotopy (15N, 2H) a buněčné modely pro širší metabolické mapování.
• Přidání automatizovaných a vysokoprůchodových platforem pro flux analýzu.
• Vývoj pokročilých softwarových nástrojů pro komplexní interpretaci izotopologových dat.

Závěr

Kombinace Seahorse XF analýzy a 13C stabilně izotopického trasování přináší ucelený obraz energetické a metabolické odpovědi makrofágů na LPS stimulaci a otvírá cestu k detailnímu zkoumání buněčného metabolismu.

Reference

• O’Neill L.A. et al. Nat Rev Immunol. 2016.
• Loftus R.M., Finlay D.K. J Biol Chem. 2016.
• Kelly B., O’Neill L.A. Cell Res. 2015.
• Lampropoulou V. et al. Cell Metab. 2016.
• Mills E.L. et al. Nature. 2018.
• Kam Y. et al. Agilent Seahorse XF. 2018.