Illuminating the Cellular and Molecular Response to Drug Treatment by Combining Bioenergetic Measurements with Untargeted Metabolomics

Význam tématu

Rychlé a komplexní sledování metabolických změn v buňkách je klíčové pro vývoj a hodnocení protinádorových látek. Kombinace bioenergetických měření na buněčné úrovni a neřízené metabolomiky umožňuje hlubší pochopení farmakologické odezvy a odhalení nových cílových biomarkerů.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na integrované využití technologie Seahorse XF pro měření produkce ATP a neřízené LC/MS metabolomiky a lipodomiky k popisu biologické odezvy buňek THP-1 po léčbě inhibitory tyrosinových kináz AG-879 a SU1498. Cílem bylo odhalit změny v energetickém metabolismu a molekulárních profilech metabolitů a lipidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Seahorse XF Pro Analyzer – real-time měření glykolytického a mitochondriálního ATP, Mito Stress Test
• Agilent Novocyte Quanteon – počítání buněk a hodnocení viability
• Agilent Bravo Liquid Handling Platform – automatizovaná extrakce metabolitů a lipidů
• HILIC-LC na Agilent 1290 Infinity II Bio LC
• Agilent Revident LC/Q-TOF – vysoko rozlišená LC/MS analýza
• Agilent MassHunter Explorer – zpracování dat metabolomiky a lipodomiky
• Agilent Lipid Annotator – anotace lipidů

Hlavní výsledky a diskuse

• Screening 80 inhibitorů odhalil AG-879 a SU1498 jako silné modulátory mitochondriální produkce ATP, přičemž SU1498 specificky ovlivnil buněčné linie THP-1.
• Seahorse XF: oba inhibitory zvýšily glykolytickou produkci ATP, snížily produkci mitoATP a vyvolaly zvýšený proton leak, indikující mitochondriální uncoupling.
• Metabolomika (HILIC(-)): zaznamenán pokles klíčových intermediátů glykolýzy (glukóza-6-fosfát, fruktóza-1,6-bisfosfát) a nárůst pantothenátu, korelující se změněnými ATP profily.
• Lipodomika: z 4476 detekovaných funkcí bylo anotováno 677 lipidů; SU1498 vedl k nárůstu triacylglycerolů a ceramidů, což může souviset s akumulací energetických rezervoárů.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrovaný přístup zlepšuje schopnost odhalit farmakologické efekty na energetický i molekulární metabolismus.
• Metodika umožňuje rychlý screening nových drogových kandidátů a identifikaci specifických metabolických dráh.
• Automatizovaná příprava vzorků zvyšuje reprodukovatelnost výsledků a zkracuje dobu analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření o kvalitativní a kvantitativní metabolické flux analýzy pro sledování dynamiky metabolitů.
• Použití Seahorse XF Substrate Oxidation Stress Test k určení závislosti buněk na konkrétních substrátech.
• Další zkoumání neznámých, ale statisticky významných funkcí za účelem objevení nových biomarkerů.

Závěr

Společné využití Seahorse XF a neřízené LC/MS technik poskytuje komplexní pohled na metabolickou odezvu nádorových buněk na inhibitorové léčby. Výsledky potvrzují mitochondriální uncoupling, přesměrování energetického metabolismu a identifikují specifické změny v profilech metabolitů a lipidů. Tento integrovaný přístup nabízí silný nástroj pro vývoj a hodnocení anticancerových sloučenin.

Reference

• Van de Bittner GC et al. An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples. Agilent Techn. Overview 5994-5065EN, 2022.
• Kam Y et al. Rapid Bioenergetic Functional screening of Anticancer Drug Candidates. Agilent App. Note 5994-5651EN, 2023.
• Mohsin S et al. High confidence targeted data mining of untargeted high-resolution data for lipids in plasma. ASMS Poster MP 463, 2023.
• Hyunh K et al. A Comprehensive, Curated, High-Throughput Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome. Agilent App. Note 5994-3747EN, 2021.