A tandem capillary and micro-flow LC workflow for high-throughput quantitative proteomics at near 100% mass spectrometer utilization

Význam tématu

Vysokopropustná LC-MS analýza je klíčová pro moderní kvantitativní proteomiku, kde je třeba kombinovat rychlost analýzy s vysokou využitelností hmotnostního spektrometru a robustností chromatografického systému. Mikrokapilární a mikroprůtokové režimy nabízejí kompromis mezi citlivostí nano-flow LC a stabilitou vyšších průtoků, což umožňuje efektivní profilování stovek vzorků denně.

Cíle a přehled studie / článku

Tento příspěvek prezentuje hodnocení tandemového kapilárního/mikro-průtokového pracovního postupu (TDI) na systému Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC v kombinaci s Orbitrap Exploris 240 MS. Hlavním cílem bylo maximalizovat využití MS (>90 %) při propustnostech 48 až 277 vzorků za den a zároveň zachovat vysokou reprodukovatelnost retence a kvantifikace.

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní postup TDI využívá dvě LC pumpy a dvě chromatografické kolony umístěné v objemné komoře, přepínané postkolonovým ventilem tak, aby se zatěžovala druhá kolona během akvizice na první. Jako sorbenty byly použity dvojité nanoViper PepMap Neo kolony (150 μm × 15 cm) pro kapilární režim a Acclaim PepMap 100 kolony (300 μm a 1 mm I.D.) pro mikroprůtok.

• Separace a gradient: 1–15 μL/min pro mikroréžim, 250–1 500 nL/min pro kapilární režim
• Iontový zdroj: EASY-Spray kapilární a nízkoprůtokový metal needle insert
• MS akvizice: Orbitrap Exploris 240 v režimu data independent acquisition (DIA)
• Software: CHIMERYS DIA node nebo Spectronaut 19 s FDR <1 % na hladině peptidů a proteinů

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace chromatografie ukázala, že průtoky nad 1 μL/min neovlivňují významně šířku píku, což umožnilo jednoduché nasazení postkolonového ventilu. Při 180 vzorcích za den (SPD) na kolóně 150 μm × 150 mm byly identifikovány 3 111–4 281 proteinových skupin z 50–1 000 ng HeLa digestu s mediánovou RSD retence 4 % a RSD abundancí 6 %. Interkolonová variabilita CV<10 % byla zajištěna pro více než 3 200 proteinových skupin. Systém umožňuje zvýšení propustnosti až na 240 SPD na kolóně 300 μm × 15 cm s identifikací 2 282 proteinových skupin z 200 ng digestu. Nejvyšší propustnost 277 SPD (1 μg digestu) přinesla 2 400 ID proteinových skupin.
Redukce carryover byla dosažena rozšířenými mycími cykly, přičemž pro 200 ng HeLa digestu dosáhla carryover pouhých ~0,03 % a pro 1 μg cestou mikroréžimu ~0,35 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou propustnost při zachování citlivosti a reprodukovatelnosti, což je výhodné pro rozsáhlé proteomické projekty, QA/QC a rutinní aplikace ve farmaceutickém či klinickém výzkumu. Inteligentní řízení workflow a optimalizované chromatografické podmínky minimalizují prodlevy a zvyšují efektivitu analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Mikro-bore kolony s průtoky 0,3–1 mm I.D. slibují další zvýšení propustnosti a robustnosti. Kombinace s inovativními zdroji ESI a pokročilými algoritmy pro zpracování dat umožní rozšíření metody na analýzu malých vzorků, single-cell proteomiku či rychlé skríningové aplikace.

Závěr

Tandemový kapilárně-mikroprůtokový workflow na systému Vanquish Neo UHPLC v kombinaci s Orbitrap Exploris 240 MS poskytuje >90 % využití hmotnostního spektrometru, vysokou přesnost retence a kvantifikace a propustnost až 277 vzorků za den. Metoda je robustní, reprodukovatelná a vhodná pro široké spektrum proteomických aplikací.

Reference

1. Zheng R et al. Thermo Fisher Scientific, Technical Note 003335 (2024)
2. Bian Y et al. Robust, reproducible and quantitative analysis of thousands of proteomes by micro-flow LC–MS/MS. Nature Communications 2020, 11, 157
3. Zheng R et al. Thermo Fisher Scientific, Technical Note 000138 (2021)