Enhanced sensitivity of the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for deeper proteome coverage in single-cell proteomics applications

Význam tématu

Single-cell proteomika poskytuje detailní vhled do heterogenity jednotlivých buněk a jejich molekulárních procesů, které nelze detekovat hromadnou analýzou. Pro úspěšné nasazení v biomedicínském výzkumu či klinické diagnostice je nezbytná vysoká citlivost, hluboké pokrytí proteomu a dostatečná propustnost analýzy při extrémně nízkých množstvích vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkonnost nového Orbitrap Astral Zoom hmotnostního spektrometru při analýze nízkých vstupních množství (50–250 pg) i jednotlivých buněk (HEK single cells). Studie porovnává Orbitrap Astral Zoom s předchozí generací Orbitrap Astral MS ve „Low Input" režimu s datově-nezávislým získáváním (DIA) a bez nutnosti použití spektrálních knihoven.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: komerční digesty HeLa a K562 (Promega) a jednotlivé buňky HEK293F.
• Příprava: 100 ng/µl digestu ředěno na požadované koncentrace, FACS separace HEK buněk, lýza v TEAB/TFE, proteolýza trypsinem, zastavení reakce TFA.
• Separační systém: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC, kolony Aurora Ultimate 25 cm C18 pro 50–120 SPD a Aurora Rapid 8 cm C18 pro vysokou propustnost.
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom MS s FAIMS Pro Duo rozhraním (CV –48 V, plyn 3,5 L/min), DIA metoda, akviziční rychlost až 270 Hz.
• Data processing: Proteome Discoverer (CHIMERYS), Spectronaut v19.6 (directDIA) s FDR 1 % na úrovni prekurzoru, peptidu a proteinu.

Hlavní výsledky a diskuse

• K562 digest: identifikováno >5 200 proteinových skupin z 50 pg a >6 100 skupin z 250 pg při 50 SPD.
• HeLa digest: z 50 pg 3 700 skupin při 120 SPD a >5 600 skupin při 50 SPD; z 250 pg >5 100 skupin při 120 SPD a >6 800 skupin při 50 SPD.
• HEK single cells: průměrně >5 800 proteinových skupin při 50 SPD pomocí library-free directDIA.
• Porovnání Orbitrap Astral Zoom vs. Orbitrap Astral MS ukázalo ~10 % zisk identifikací u 50 pg a ~5 % u 250 pg vzorků.
• Reprodukovatelnost: CV mediánu proteinových skupin <6 % pro K562, <5 % pro HeLa (triplikáty) a <20 % CV pro většinu identifikovaných skupin v celé diluční řadě.

Přínosy a praktické využití metody

Orbitrap Astral Zoom MS nabízí zvýšenou citlivost díky zlepšeným iontovým optikám a rychlejší akvizici, což umožňuje hlubší proteomické pokrytí při nízkých vstupních množstvích. Library-free directDIA workflow v Spectronautu eliminuje potřebu předchozích spektrálních knihoven, zjednodušuje analýzu a urychluje proces.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s multiplexními barvivy a isobarickými značeními pro zvýšení throughput.
• Automatizace předzpracování a použití strojového učení pro pokročilou analýzu dat.
• Rozšíření aplikací do klinické proteomiky, biomarkerových studií a personalizované medicíny.
• Další optimalizace FAIMS nastavení a vývoj ještě citlivějších iontových detektorů.

Závěr

Orbitrap Astral Zoom MS v kombinaci s UHPLC a directDIA přináší významné zlepšení v citlivosti, proteomové hloubce pokrytí a propustnosti analýzy nízkoobjemových a single-cell vzorků. Metoda vykazuje vysokou reprodukovatelnost a odhaluje tisíce proteinových skupin z femtogramových množství materiálu.

Reference

• Tabiwang N. Arrey et al. Deeper proteome coverage and faster throughput for single-cell samples on the Orbitrap Astral mass spectrometer, Technical note 002780.