High-sensitivity Host Cell Protein (HCP) analysis on a new Orbitrap Excedion Pro BioPharma hybrid mass spectrometer with optimized sample preparation

Význam tématu

Host cell proteiny (HCP) jsou zbytky proteinů původní buněčné linie používané při výrobě rekombinantních bioterapeutik. Přítomnost HCP nad stanovenými limity může ovlivnit bezpečnost, účinnost a stabilitu finálního léčiva. Tradiční kvantifikace ELISA nedokáže odhalit jednotlivé HCPs a jejich imunogenní potenciál, proto se stále více využívá vysoko citlivá LC-MS/MS analýza.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo zhodnotit schopnosti nového hmotnostního spektrometru Orbitrap Excedion Pro BioPharma pro profilování HCPs a porovnat dva přístupy přípravy vzorku: nativní trypsinovou hydrolýzu a Protein A depleci s EasyPep protokolem. Studii prováděli na standardizovaném NISTmAb a na klinickém vzorku trastuzumabu, aby se ověřila citlivost, reprodukovatelnost a rozsah detekce nízkokoncentrovaných HCP.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Excedion Pro BioPharma hybridní hmotnostní spektrometr (Thermo Fisher Scientific)
• UHPLC kolona Acclaim Vanquish C18 2.1×250 mm, průtok 300 μL/min
• Software Proteome Discoverer 3.2 s CHIMERYS a Sequest HT vyhledávacími algoritmy

Použitá metodika

Vzorky NISTmAb a trastuzumabu byly připraveny dvěma způsoby:

• Nativní trypsinová digesce při 2 mg/mL v optimalizovaném pufru
• Protein A deplece a následná EasyPep digesce s magnetickými kuličkami

Peptidové směsi byly separovány gradientem 135 minut na analytickém flow UHPLC a analyzovány DDA MS2 režimem (120 000 rozlišení, top 15, m/z 350–1 200). Data byla vyhodnocena s <1 % FDR a minimálně 2 unikátními peptidy na protein.

Hlavní výsledky a diskuse

U NISTmAb bylo identifikováno 163 HCPs nativní digescí, reprodukovatelnost mezi trojitými injekcemi prokázala CV 1,08 %. Rozsah detekovaných HCP se pohyboval od 100 ppm po 0,007 ppm (Glutathione S-transferase P). Porovnání s literaturou (Beaumal et al.) potvrdilo 128 sdílených HCP a 31 nově detekovaných proteinů. U trastuzumabu nativní přístup odhalil 874 HCPs, zatímco EasyPep protokol 1 550 HCPs. Společných bylo 670 proteinů, 48 bylo unikátních pro nativní digesci a zbylé pro EasyPep. EasyPep prokázal vyšší účinnost v identifikaci nízkokoncentrovaných HCPs bez ztráty vysokokoncentrovaných.

Přínosy a praktické využití metody

Nová platforma nabízí ultracitlivou detekci HCPs s širokým dynamickým rozsahem a vynikající stabilitou výsledků. Užitečná je pro kontrolu kvality a validaci procesů v bioprodukci, kde je nutné monitorovat i nízce abundantní nečistoty. Analytický flow UHPLC zajišťuje snadnou údržbu a vysokou robustnost metody.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace různých přístupů přípravy vzorku pro kompletní mapování HCPs. Automatizované a vyšší průchodové platformy s kvantifikačními standardy umožní rozsáhlé srovnání bioterapeutik a rychlejší validaci procesů. Dále se vyvíjejí algoritmy pro zlepšení selektivního vyhledávání nízkokoncentrovaných proteinů.

Závěr

Studie demonstrovala, že nový Orbitrap Excedion Pro BioPharma umožňuje vysoce citlivé a reprodukovatelné profilování HCPs. Protein A deplece s EasyPep digescí významně rozšiřuje počet identifikovaných nízkokoncentrovaných HCPs, zatímco nativní digesce přispívá k doplnění kompletního přehledu. Kombinace obou protokolů poskytuje nejucelenější seznam potenciálních nečistot.

Reference

1. Huang T., et al. A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies. Anal. Chem. 89(10):5436–5444, 2017.
2. Jae C., et al. EasyPep sample enrichment & quantitation of host cell proteins. Thermo Fisher Scientific poster PO220, 2024.
3. Beaumal C., et al. Proteomics, 2023, doi:10.1002/pmic.202300172.