Applying UHPLC HRAM MS-MS/MS method to assess host cell protein clearance during the purification process development of therapeutic mAbs

Význam tématu

Host cell proteiny (HCP) představují klíčové procesní nečistoty v produkci terapeutických monoklonálních protilátek. Jejich účinné odstraňování a kvantifikace je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a efficacy finálního produktu. Tradiční ELISA metody poskytují celkovou hladinu HCP, ale nenabízejí detailní informaci o jednotlivých proteinech. UHPLC HRAM MS‐MS/MS přináší vysokou citlivost a specifickou identifikaci jednotlivých HCP napříč procesem čištění.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout univerzální platformní UHPLC HRAM MS‐MS/MS metodu pro monitorování clearance HCP během jednotlivých stupňů downstream purifikace trastuzumabu. Metoda byla optimalizována a otestována na referenčním NISTmAb materiálu a následně aplikována na dvě in‐house vzorky odebírané z Protein A a Polish pool kroků.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly štěpeny trypsinem za nedenzatačních podmínek dle protokolu Huang et al. Každý vzorek (~1 mg mAb) prošel buffer exchange do 50 mM Tris‐HCl, následně 2h inkubací s trypsinem (enzym/protein ratio 1:800) při 37 °C, redukcí pomocí TCEP a acidifikací formiátovou kyselinou. Rozštěpené peptidy byly separovány na 25 cm C18 kolóně s 90min lineárním gradientem při průtoku 300 µL/min a teplotě 60 °C.

Použitá instrumentace:

• Vanquish Flex UHPLC system s Acclaim VANQUISH C18 kolónou (2.1 × 250 mm, 2.2 µm)
• Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid mass spectrometr (ESI, rozlišení Full MS 120 000 @200 m/z, MS/MS 30 000 @200 m/z)
• Proteome Discoverer 3.1 (Sequest HT a CHIMERYS vyhledávací algoritmy, Percolator 1% FDR)

Hlavní výsledky a diskuse

Na NISTmAb referenčním materiálu bylo identifikováno 235 HCP v rozsahu koncentrací od 0.007 ppm. V Protein A poolu trastuzumabu bylo zjištěno 385 HCP, v polish poolu 91 HCP. Metoda vykázala výbornou opakovatelnost: 80 % HCP mělo CV ≤15 % (n=3). POROS Caprylate mixed‐mode pryskyřice dosáhla odstranění více než 80 % HCP včetně vysoce rizikových a obtížně odstraňovaných proteinů. Výrazného snížení abundancí bylo dosaženo i pro nízkokoncentrované cíle.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou selektivitu a citlivost pro sub-ppm detekci HCP
• Komplexní profilaci jednotlivých HCP napříč procesními kroky
• Možnost kvantitativního sledování clearance při vývoji a optimalizaci purifikace
• Uplatnění v QA/QC pro validaci čisticích procesů a kontrolu consistency výroby

Budoucí trendy a možnosti využití

Mezi perspektivní směry patří:

• Automatizace datových analýz a využití strojového učení pro predikci HCP rizikovosti
• Rozšíření na další biologické produkty včetně bispecifických mAb a rekombinantních proteinů
• Implementace online UHPLC-MS workflow pro kontinuální monitorování výroby
• Vývoj multiplexních kvantitativních metod využívajících izotopově značené standardy

Závěr

Vyvinutá UHPLC HRAM MS‐MS/MS platforma pro analýzu HCP prokázala vysokou citlivost, rozsah pokrytí a opakovatelnost při testování na NISTmAb i in‐house trastuzumabu. Metoda umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci jednotlivých HCP v různých stupních purifikace a podporuje efektivní vývoj a validaci downstream procesů.

Reference

• Beaumal C. et al., Proteomics 2023 May 6. DOI 10.1002/pmic.202300172
• Huang X. et al., Analytical Chemistry 2017;89(10):5436–5444. DOI 10.1021/acs.analchem.7b00304
• Thermo Fisher Scientific, POROS Caprylate Mixed-Mode Cation Exchange Resin, A51049
• Biophorum, Host cell protein searchable database
• Singh S. et al., Biotechnology Progress 2019;1–12