Increasing sensitivity of high throughput host cell protein analysis on a novel high- resolution accurate mass platform

Význam tématu

Analýza stopových úrovní hostitelských proteinů (HCP) v bioterapeutikách je zásadní pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a stability léčiv. Standardní metody, jako ELISA, poskytují souhrnnou hodnotu HCP, ale nedokážou kvantifikovat jednotlivé proteiny v širokém dynamickém rozsahu. Moderní přístupy na bázi LC-MS umožňují cílenou identifikaci a kvantifikaci HCP na sub-ppm úrovních.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo otestovat výkonnost nové platformy Orbitrap™ Astral™ pro rychlé a citlivé zjišťování low-ppm až sub-ppm HCP nečistot v modelovém přípravku NISTmAb. Studie porovnává počet identifikovaných HCP, dobu analýzy a kvalitu spekter s literárními daty Beaumal et al.

Použitá metodika a instrumentace

• Proteolýza: SMART Digest™ kit s immobilizovaným trypsinem, non-denaturační podmínky (37 °C, 3 h) vs. denaturační digest (70 °C, 30 min).
• Ukrocení dynamického rozsahu: odstranění nestráveného mAb srážením při 95 °C a centrifugací.
• Chromatografie: Vanquish™ Neo UHPLC v Trap & Elute režimu, EASY-Spray™ PepMap™ Neo kolonka 150 µm × 15 cm, gradient 20,2 min, průtok 0,8 µl/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ v režimu data independent acquisition (DIA), izolační okna 3 Th, rychlost skenování až 200 Hz, HRAM MS2.
• Software: Proteome Discoverer™ 3.1 s Chimerys™ algoritmem, databáze UniProt Mus musculus, filtrace <1 % FDR a ≥2 unikátní peptidy na protein.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikováno více než 130 HCP v NISTmAb, srovnatelně k 115–133 HCP publikovaným literaturou.
• Doba analýzy zkrácena na 20,2 min gradient (60 vzorků/den), tedy přibližně 5× rychleji než běžné metody.
• Detekční limit sub-ppm až nízké ppb úrovně, potvrzené korelací s naměřenými koncentracemi Beaumal et al.
• Vysoká kvalita MS2 spekter i pro nízkou abundanci HCP, robustní identifikace napříč koncentracemi od 0,007 ng/mg mAb po stovky ppm.
• Non-denaturační digest zlepšuje detekci HCP díky selektivní odolnosti mAb struktury vůči trypsinu a snížení dynamického rozsahu peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a citlivá kontrola čistoty bioterapeutik v QA/QC a výzkumných laboratořích.
• Možnost kvantifikace jednotlivých HCP při zachování vysoké propustnosti.
• Vhodné pro kontinuální monitoring HCP během vývoje a výroby monoklonálních protilátek.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření DIA metodiky o širší izolační okna a vyšší rozlišení pro komplexnější proteiny.
• Integrace automatizace a robotizace vzorkové předpřípravy pro větší propustnost.
• Využití pokročilých datových analýz, včetně strojového učení pro predikci a eliminaci HCP rizik.
• Adaptace platformy na jiné třídy bioterapeutik (rekombinantní proteiny, fusion proteiny, viral-vectored produkty).

Závěr

Implementace Orbitrap Astral spektrometru a non-denaturačního workflow umožnila rychlou identifikaci více než 130 HCP v NISTmAb na sub-ppm úrovních s významným zkrácením analýzy. Metoda nabízí silné zázemí pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

• Huang L. et al., Anal. Chem. 2017, 89(10), 5436–5444.
• Claydon A. et al., Thermo Scientific App. Note no. 73412, 2020.
• Beaumal C. et al., Proteomics. 2023 May 6, doi:10.1002/pmic.202300172.
• Johnson B. et al., Anal. Chem. 2020, 92(15), 10478–10484.