Enhanced HCP quantitation LC-MS/MS workflow solution using a MS sample prep method

Význam tématu

Analýza hostitelských proteinů (HCP) je klíčová pro zajištění bezpečnosti a kvality bioterapeutik. Tradiční ELISA metody mohou opomíjet neimunogenní HCP a neposkytují detailní kvantifikaci jednotlivých proteinů. LC-MS/MS umožňuje selektivní identifikaci a kvantifikaci rizikových HCP, čímž doplňuje a zpřesňuje kontrolu procesů produkce protilátek.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit vylepšený pracovní postup pro kvantifikaci HCP v bioterapeutikách. Studie porovnává tři přístupy přípravy vzorku:

• nativní tryptická digestce,
• EasyPep digestce po protein A depleci,
• semi-tryptické eluce HCP vyvolané trypsinem po protein A depleci.

Metoda byla testována na protéinech rituximab, trastuzumab, a standardním vzorku NISTmAb, včetně cílené kvantifikace 28 vysokorizikových CHO HCP peptidů pomocí heavy-labeled AQUA standardů.

Použitá metodika

Pracovní postup zahrnoval:

• Antibody depletion pomocí Pierce high-capacity protein A MagBeads.
• EasyPep digestion s následnou trypsin elucí pro obnovu slabě vázaných HCP.
• Přídavek heavy-labeled AQUA peptidů v šesti koncentracích (0,03–200 fmol) pro stanovení linearity a LLOQ.
• PRM analýza na Q Exactive Plus se Skyline pro vyhodnocení ploch chromatografických píků.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Pierce high-capacity protein A MagBeads
• Thermo Scientific EasyPep Sample Preparation Kit
• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano System
• Thermo Scientific Q Exactive Plus Mass Spectrometer
• Thermo Scientific Proteome Discoverer 3.0 Software
• Skyline open source software

Hlavní výsledky a diskuse

Protein A-depletovaný EasyPep postup významně zvýšil počet identifikovaných HCP:

• Trastuzumab: 1575 vs. 859 (nativní digest) vs. 563 (depletovaný nativní digest).
• NISTmAb: 807 vs. 235 HCP při srovnání EasyPep vs. nativní digest.
• Rituximab: 13 vs. 3 unikátních HCP při EasyPep vs. nativní přístupu.

Vyhodnocení PRM ukázalo vynikající linearitu (R² ≥ 0,95) a LLOQ 0,03 fmol pro většinu heavy peptidů. Implementace trypsin eluce podstatně zlepšila návrat nízkých koncentrací HCP, čímž rozšířila rozsah detekce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vyšší citlivost a přesnost kvantifikace jednotlivých HCP.
• Rozšířenou detekční kapacitu, zlepšenou reprodukovatelnost a robustnost.
• Orthogonální doplněk k ELISA, vhodný pro QA/QC procesy ve výrobě bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími kroky mohou být:

• Automatizace a miniaturizace workflow pro high-throughput screening.
• Rozšíření panelu heavy peptidů pro další rizikové HCP.
• Integrace umělé inteligence pro rychlou interpretaci dat.
• Využití mikroflow LC-MS/MS pro zkrácení analýzních časů.

Závěr

Použití protein A-depletovaného EasyPep protokolu v kombinaci s heavy-labeled AQUA standardy a PRM výrazně zvyšuje citlivost a rozsah identifikace HCP v bioterapeutikách. Navržený workflow podporuje detailní monitoring kvality a napomáhá k plnění regulatorních požadavků.

Reference

1. Jones et al (2021) High-risk host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnol Bioeng. 2021 Aug;118(8):2870-2885.