Improved accuracy and identification in label-free quantitative proteomics with the OptiSpray Ion Source and separation cartridge with integrated replaceable emitters

Význam tématu

Label-free kvantifikace (LFQ) proteomů založená na hmotnostní spektrometrii je klíčová pro studium proteinové exprese, biologických mechanismů a onemocnění. Přesnost a reprodukovatelnost kvantifikace ovlivňuje spolehlivost vědeckých závěrů a rozhodovacích procesů v průmyslu i výzkumu. Zlepšení stability iontového zdroje a chromatografického běhu přispívá k robustnějším a opakovatelnějším výsledkům.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit, jak implementace nového automatizovaného OptiSpray Ion Source se separační kazetou s vyměnitelnými emitery ovlivní přesnost měření a identifikaci proteinů v LFQ experimentech. Studie využila tři různé DIA metody s gradienty 9, 30 a 60 minut na µPAC Neo 50 cm kolóně a porovnávala výkonnost s a bez FAIMS rozhraní. Testovány byly jednoproteomové (HeLa) i vícesložkové směsi (HeLa, E. coli, kvasinky) a dvousložkové poměry pro hodnocení poměrové přesnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Systém: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC spojený s Orbitrap Exploris 480 MS a FAIMS Pro Duo.
Ion source: OptiSpray Ion Source s kazetou obsahující µPAC Neo 50 cm kolónu a 15 µm emitery.
Vzorky: HeLa digest, E. coli Digest Standard, Yeast Digest; 1 µL injekce v triplikátu.
Metody: DIA se 2–4 MS experimnty v rámci 15, 40 a 75 min metod; FAIMS CV –50 až –60 V; MS1 rozlišení 45–60 000, MS2 22 500–30 000.
Software: Spectronaut 19.5, Proteome Discoverer 3.2 s CHIMERYS, DIA-NN 2.0, Skyline 24.1.

Hlavní výsledky a diskuse

OptiSpray zdroj zlepšil stabilitu rozprašování a snížil koeficient variace (CV) množství peptidů. U vysoce průtokových metod klesly CV u nízkoabundantních peptidů z 16 % na 8 % a u abundantních z 6 % na 2 %. Během 170 h kontinuálního měření zůstala plocha PRTC peptidů stabilní (CV 2,4 %), identifikace peptidů a proteinů měly CV kolem 1,0–1,2 % a retenční časy PRTC odchylky 0,18–0,86 %. Kombinace OptiSpray a FAIMS rozšířila pokrytí peptidů a zvýšila počet identifikovaných proteinů oproti standardnímu EASY-Spray zdroji. Poměrové chyby (<10 %) byly konzistentní napříč vzorky s průměrem 4,5 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená přesnost a reprodukovatelnost LFQ měření
• Vyšší počet identifikovaných proteinů při krátkých i dlouhých gradientech
• Robustnost v dlouhodobé QC analýze
• Automatizovaná kalibrace polohy emitru pro snadnější obsluhu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace šířky DIA oken a overlapu pro snížení CV, integrace s pokročilými softwarovými nástroji pro hlubší datovou analýzu, aplikace v klinické proteomice a PTM studiu, rozšíření automatizace pro vysokopropustné vzorkování a spojení s dalšími technikami gazové fáze pro lepší separaci peptidů.

Závěr

Automatizovaný OptiSpray Ion Source s vyměnitelnou kolónovou kazetou významně zlepšuje stabilitu iontového rozprašování, což vede k vyšší přesnosti kvantifikace a rozšířenému počtu identifikací proteinů v label-free proteomických aplikacích. Kombinace s FAIMS nabízí další zvýšení pokrytí a robustnosti dat.

Reference

• FASTA contaminants file: doi:10.1101/2022.04.27.489766
• Spectronaut 19.5, Biognosys AG
• Proteome Discoverer 3.2, Thermo Fisher Scientific
• DIA-NN 2.0
• Skyline 24.1, MacCoss Lab