High Select Fe-NTA magnetic beads for phosphopeptide enrichment

Význam tématu

Analýza fosfoproteomu pomocí hmotnostní spektrometrie vyžaduje účinné obohacení fosforylovaných peptidů z komplexních biologických vzorků. Nízká zastoupení fosforylací v matrici a jejich klíčová úloha v buněčných signálních drahách určují potřebu metod s vysokou selektivitou, výtěžností a reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat nový kit High-Select Fe-NTA magnetických kuliček pro obohacení fosfopeptidů. Studie porovnala tento kit s tradičními Fe-NTA spin-column a konkurenčními magnetickými pryskyřicemi z hlediska:

• fosfospecifičnosti a počtu identifikovaných fosfopeptidů,
• kapacity vazby,
• reprodukovatelnosti mezi šaržemi,
• rychlosti workflow a kompatibility s automatizační platformou.

Použitá metodika

Vzorky z lidských HeLa buněk byly lizovány, redukovány, alkylovány a digesovány trypsinem. Po stanovení koncentrace peptidů byly vzorky očistěny na tC18 kolonkách a následovalo obohacení fosfopeptidů:

• inkubace peptidů s magnetickými Fe-NTA kuličkami (poměr 1:50, w/w),
• sekvenční praní dvěma předformulovanými pufry,
• eluce fosfopeptidů, sušení a příprava na LC-MS analýzu,
• manuální i automatizovaný režim na platformě KingFisher Apex.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLCnano systém
• Thermo Scientific EASY-Spray C18 kolona (PN#E903)
• Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybridní kvadrupól-Orbitrap MS
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 MS
• Thermo Scientific Proteome Discoverer 3.1 software
• Thermo Scientific KingFisher Apex Purification System

Hlavní výsledky a diskuse

Magnetické Fe-NTA kuličky dosáhly:

• fosfospecifičnost ≥ 90 % a nízké CV mezi replikáty (< 5 %),
• identifikace přes 12 000 fosfopeptidů na vzorek,
• vazebná kapacita 17–19 µg fosfopeptidů na µg kuliček,
• vynikající reprodukovatelnost napříč devíti výrobními šaržemi,
• výrazné zkrácení počtu kroků workflow (11 vs. 19) a doby zašpinění rukou (2 h vs. až 3 dny) oproti konkurenci,
• srovnatelná výkonnost při manuálním i automatizovaném zpracování na KingFisheru.

Přínosy a praktické využití metody

Nový kit přináší:

• jednodušné a škálovatelné workflow vhodné pro vysoko kapacitní proteomiku,
• kompatibilitu se širokým rozsahem pH (2–13) a běžnými organickými rozpouštědly,
• vysokou ekologickou a časovou efektivitu díky magnetické separaci,
• integraci s multiplexními kvantifikačními metodami (TMTpro).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• využití v klinické proteomice pro biomarkerový výzkum,
• rozšíření na obohacení dalších post-translačních modifikací,
• integrace do mikrofluidních a high-throughput platforem,
• aplikace strojového učení pro optimalizaci protokolů a analýzy dat.

Závěr

Představený High-Select Fe-NTA Magnetic Phosphopeptide Enrichment Kit poskytuje robustní a reprodukovatelnou metodiku pro obohacení fosfopeptidů s vysokou selektivitou a kapacitou. Jeho rychlé a automatizovatelné workflow otevře nové možnosti pro rozsáhlé proteomické studie.

Reference

1. Paulo J. A., Liu et al. Fe3+-NTA Magnetic Beads as an Alternative to Spin Column-Based Phosphopeptide Enrichment. Journal of Proteomics, 260 (2022) 104561.
2. Kimura Y., et al. Evaluation of Four Phosphopeptide Enrichment Strategies for MS-Based Proteomic Analysis. Proteomics, 22 (2022) 2100216.