Automation of Phosphoenrichment using Magnetic Fe-NTA Beads and KingFisher™ Apex Magnetic Particle Processor

Význam tématu

Phosphorylace je klíčová posttranslační modifikace regulující funkci mnoha proteinů a jejich signalizační dráhy. Díky nízké stoichiometrii fosforylovaných peptidů v biologických vzorcích je nezbytné provést selektivní obohacení před analýzou hmotnostní spektrometrií. Automatizace tohoto procesu je důležitá pro vysokou propustnost, reprodukovatelnost a minimalizaci variability mezi vzorky, což je zásadní zejména v klinických a výzkumných aplikacích zaměřených na studium onemocnění souvisejících s poruchami fosforylace.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo optimalizovat workflow pro obohacení fosfopeptidů pomocí Fe-NTA agarózových magnetických kuliček v kombinaci s plně automatizovaným přístrojem KingFisher™ Apex. Studie zahrnuje porovnání manuálního a automatizovaného protokolu, vyhodnocení poměru kuliček k vzorku, objemu a typu mytí a možnosti oplachu destilační plotny.

Použitá metodika

• Příprava vzorků: HeLa S3 buňky ošetřené nocodazolem a vzorky mozkomíšního moku (CSF) enzymaticky štěpené pomocí sady EasyPep™ Maxi MS.
• Obohacení: Inkubace peptidů s Fe-NTA magnetickými kuličkami, organické a vodné mytí, eluční pufr, optimalizace poměru kuliček k peptidům (1:10, 1:20, 1:50), objemu mytí (100 μl vs. 500 μl) a jedno/minutového elučního času.
• Čištění: Desalting peptidů na směsné resině po obohacení ke snížení kontaminant.
• Analýza LC-MS: Nanovrstvené chromatografické dělení (50 cm C18 kolona, gradient 3–45 % acetonitrilu) a detekce na Orbitrap™ Q Exactive™ Plus a Orbitrap™ Eclipse™ Tribrid™.
• Vyhodnocení: Lokalizace fosforylačních míst pomocí Proteome Discoverer™ 2.4, kvantifikace peptidů a posouzení specificity fosfopeptidů a variability mezi replikáty.

Použitá instrumentace

• KingFisher™ Apex Magnetic Particle Processor
• Thermo Scientific™ EasyPep™ Maxi MS Sample Prep Kit
• Thermo Scientific™ Orbitrap™ Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™
• Thermo Scientific™ Orbitrap™ Eclipse™ Tribrid™
• Thermo Scientific™ Dionex™ Ultimate™ 3000 Nano LC System
• Thermo Scientific™ Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay

Hlavní výsledky a diskuse

Optimální poměr kuliček k peptidům (1:50) maximalizoval specificitu (~97 %) s menší ztrátou počtu identifikovaných fosfopeptidů (~11 000 ID). Objem mytí 100 μl a otoření destilační plotny vedlo k lepší reprodukovatelnosti a vyššímu počtu ID při zachování vysoké specificity (~95–97 %). Reprodukční variabilita (CV <5 %) byla srovnatelná mezi manuálním a automatizovaným procesem. Aplikace na CSF ukázala nárůst počtu fosfopeptidů o ~200 a detekci významných biomarkerů, např. fosforylovaného Fibulinu-1.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: kompletní workflow <7 hodin pro až 96 vzorků
• Vysoká specificita fosfopeptidů (~95–97 %)
• Nízká variabilita mezi replikáty (CV <5 %)
• Minimalizace ruční práce a rizika kontaminace
• Možnost aplikace na klinické vzorky (CSF, tkáňové extrakty)

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na studium dalších posttranslačních modifikací pomocí adaptovaných afinitních kuliček
• Integrace s mikrofluidními platformami pro výzkum single-cell fosfoproteomiky
• Využití v klinických screeninzích a personalizované medicíně pro biomarkery onemocnění
• Další automatizační úlohy: paralelní obohacení, online kompatibilita s LC-MS

Závěr

Optimalizovaný automatizovaný protokol na KingFisher™ Apex s Fe-NTA magnetickými kuličkami poskytuje vysokou propustnost, excelentní specificitu fosfopeptidů a nízkou variabilitu. Výkon je srovnatelný či lepší než manuální metody a umožňuje aplikaci na komplexní klinické vzorky.

Reference

1. Dunn JD, et al. Techniques for Phosphopeptide Enrichment Prior to Analysis by Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 2010;29(1):29–54.
2. Timpl R, Chu ML, et al. Fibulins: A Versatile Family of Extracellular Matrix Proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003;4(6):479–89.