In-depth peptide mapping of biopharmaceuticals using an electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD) implemented on a modified Orbitrap hybrid MS

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčové pro detailní charakterizaci biovědeckých léčiv, umožňuje ověřit sekvenci bílkovin, lokalizovat posttranslační modifikace a odlišit izomerické aminokyseliny. Precizní informace o PTM a variantách sekvence jsou stěžejní pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce je vyvinout a ověřit komplexní metodu hlubokého peptidového mapování s využitím techniky EThcD na modifikovaném Orbitrap Excedion Pro BioPharma hmotnostním spektrometru, která v jediné LC-MS analýze dosáhne maximální pokrytí sekvence, spolehlivé detekce nízkopříspěvkových PTM a rozlišení izomerických aminokyselin.

Použitá metodika

Vzorek NISTmAb byl redukován, alkylován a digesován trypsinem. Separace proběhla pomocí UHPLC Vanquish Horizon s kolonkou Hypersil Gold Peptide (2,1×150 mm, 1,9 μm). Pro mobilní fáze se použila voda a acetonitril, obě s 0,1% kyseliny mravenčí, gradientní eluce při 250 μL/min a teplotě 45 °C.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Excedion Pro BioPharma MS (ETD/EThcD implementované v ion routing multipole)
• Vanquish Horizon UHPLC system
• Hypersil Gold Peptide kolona
• Software Thermo Scientific BioPharma Finder 5.3 (5 ppm tolerance pro prekurzor)

Hlavní výsledky a diskuse

• Jednorázovou analýzou EThcD bylo dosaženo 100% pokrytí sekvence NISTmAb digestu.
• Nízkopříspěvkové PTM (deamidace ~0,026 %) byly detekovány a kvantifikovány s vysokou důvěrou díky jasnému oddělení fragmentních iontů.
• Rozlišení Leu/Ile bylo realizováno pomocí diagnostických w-iontů (z-43, z-29), za nízkých nábojových stavů i při nízké intenzitě signálu.
• Isoasparagová kyselina byla jednoznačně identifikována díky fragmentům c+57 a z-57.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda EThcD na Orbitrap Excedion Pro nabízí vysokou citlivost, rychlé snímání i komplexní fragmentaci (ETD i HCD). To umožňuje spolehlivé mapování terapeutických proteinů v kvalitativních i kvantitativních aplikacích QA/QC, výzkumu PTM a rozlišení izomerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizovaná analýza komplexních biologických matric kombinující EThcD s pokročilou datovou interpretací.
• Integrované workflow pro rutinní QC bioterapeutik s vysokou propustností.
• Další optimalizace instrumentálních parametrů pro zvýšení citlivosti u velmi nízkých koncentrací.

Závěr

Implementace EThcD na Orbitrap Excedion Pro BioPharma MS umožňuje bezprecedentní hloubku peptidového mapování v jediné LC-MS analýze. Metoda přináší kompletní pokrytí sekvence, spolehlivou lokalizaci nízkopříspěvkových PTM a jednoznačné rozlišení izomerických aminokyselin, což představuje významný pokrok v oblasti biopharmaceutické analytiky.

Reference

1. Kjeldsen F. et al., Distinguishing Ile/Leu Amino Acid Residues in the PP3 Protein by (Hot) Electron Capture Dissociation in Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2003, 75, 1267–1274.
2. Hurtado P.P. et al., Differentiation of isomeric amino acid residues in proteins and peptides using mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2012, 31, 609–625.