Complete characterization of KADCYLA using a new Orbitrap Excedion Pro BioPharma hybrid mass spectrometer with electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD) fragmentation

Význam tématu

Antibody–drug konjugáty (ADC) představují moderní cílenou terapii v onkologii. Detailní charakterizace jejich strukturální heterogenity, hladiny konjugace (DAR), glykosidace a posttranslačních modifikací je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti. Nové nástroje s vysokým rozlišením a citlivostí rozšiřují možnosti analýzy intact molekul, podjednotek i peptidových fragmentů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo otestovat schopnosti Orbitrap Excedion Pro BioPharma hybridního hmotnostního spektrometru s EThcD fragmentací pro komplexní charakterizaci KADCYLA (ado-trastuzumab emtansine). Studie se zaměřila na přesné měření DAR, lokalizaci lysin-vazebných míst, mapování sekvence a identifikaci běžných modifikací.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky KADCYLA byly připraveny pro tři úrovně analýzy: intact molekula, podjednotky po denaturaci a peptidová mapa po digestích trypsinem a AspN. Separace probíhala na UHPLC Vanquish Horizon s MAbPac SEC-1 a RP kolony. Hmotnostní spektrometr Orbitrap Excedion Pro BioPharma využíval nativní podmínky, režim intact protein s rozlišením až 240 000 a EThcD fragmentaci. Data zpracovávala softwarová platforma BioPharma Finder, Proteome Discoverer a Ardia.

Hlavní výsledky a diskuse

• Native intact MS ukázala distribuci DAR 0–8 s průměrnou hodnotou 3,47 a minoritními složkami D8.
• Analýza podjednotek pod denaturačními podmínkami odhalila 20 chromatografických píků odpovídajících rozdílným payloadovým variantám a glykoformám.
• Peptidová mapa dosáhla 100 % sekvenčního pokrytí. EThcD fragmentace umožnila lokalizaci 43 z 46 potenciálních lysinových konjugací a identifikaci stereocenter v MCC-DM1.
• Detekovány byly i běžné PTM: methioninová oxidace, asparaginová deamidace, succinimidace a N-glykosylace (dominantní forma A2G0F 51 %).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje jednotný workflow pro komplexní charakterizaci intact ADC, podjednotek a peptidů. Vyšší rozlišení a citlivost zlepšují přesnost stanovení DAR, detekci PTM a lokalizaci vazebných míst, což podporuje vývoj a kontrolu kvality biofarmak.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další typy ADC a payloadů.
• Automatizace a integrace se softwarovými nástroji založenými na strojovém učení pro rychlejší interpretaci dat.
• Zvýšení propustnosti analýzy pro vysokoprůtokové screeningové studie a validované protokoly v regulovaném prostředí.

Závěr

Orbitrap Excedion Pro BioPharma s EThcD fragmentací prokázal vynikající výkon při charakterizaci KADCYLA. Metoda umožňuje detailní popis heterogenity, přesné měření DAR, lokalizaci konjugací i analýzu PTM na jediné platformě.

Reference

1. Pharmaceuticals 2020, 13, 245
2. Analytical Chemistry 2010, 82(17), 7485–7491