Implementation of Electron-transfer dissociation (ETD) and Electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD) on a modified Orbitrap hybrid MS

Význam tématu

Proteomická analýza využívá fragmentační techniky ke generování sekvenčně informativních fragmentů peptidů a proteinů. ETD (Electron-transfer dissociation) doplňuje klasické kolizní metody tvorbou c- a z-iontů, což zlepšuje lokalizaci posttranslačních modifikací a podporuje de novo sekvenování. Kombinace ETD s doplňkovým aktivováním (EThcD) navíc zvyšuje efektivitu rozbití ne-disociačních produktů a generuje doplňkové b-/y-ionty, čímž rozšiřuje analytické možnosti v proteomice.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje implementaci ETD a EThcD na upraveném Orbitrap Excedion Pro hmotnostním spektrometru. Cílem bylo zajistit rychlé a efektivní fragmentování pro komplexní peptidové směsi, stanovit optimální parametry (reakční doby, doplňkové aktivace) a porovnat výkonnost ETD/EThcD s konvenční HCD metodou.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Excedion Pro hybridní hmotnostní spektrometr s upraveným IRM pro dualní polaritu iontů
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC systém
• Thermo Scientific Aurora Ultimate kolona (25 cm × 75 μm) s 19,5 min gradientem
• EASY-Spray zdroj a EASY-IC/ETD zdroj radikálních aniontů (fluoranthen)
• Data dependent acquisition režim: MS1 @ 60 000, MS2 @ 15 000 rozlišení

Použitá metodika

Příprava vzorku spočívala v rozpustění lyofilizovaného HeLa tryptického digestu ve 0,1 % kyselině mravenčí. Pro analýzu byla využita DDA-ET(hc)D metoda s nastavitelností reakční doby (škálovací faktor f) a normalizované doplňkové energie (SA v % NCE). Data byla zpracována v Proteome Discoverer 3.1.1 s vlastními skripty.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované podmínky ETD zahrnují nábojově závislé reakční časy a SA energie kolem 30 % NCE. Pro EThcD byly dosaženy MS2 skenovací rychlosti přes 15 Hz. V porovnání s HCD metoda EThcD generuje o ~30 % méně PSM, avšak s vyššími Sequest XCorr skóre, což svědčí o lepší důvěře při přiřazení. Úprava škálovacího faktoru reakční doby umožňuje vyvážit hloubku analýzy a rychlost pořízení dat.

Přínosy a praktické využití metody

Technologie ETD/EThcD umožňuje spolehlivou analýzu peptidů s nízkým nábojem a lokalizaci labilních modifikací. Zvýšená rychlost skenování a kvalita spekter podporuje aplikace v kvalitativním a kvantitativním proteomickém výzkumu, top-down i middle-down sekvenování a identifikaci PTM.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zvyšování rychlosti MS2 skenování, rozvoj zdrojů radikálních aniontů a inteligentní kalibrace parametrů v reálném čase. Tyto pokroky přispějí k robustnější a automatizované analýze vysoce komplexních biologických vzorků.

Závěr

Implementace ETD a EThcD na Orbitrap Excedion Pro prokázala rychlé a kvalitní fragmentování komplexních peptidových směsí. Optimalizované parametry reakční doby a doplňkové aktivace zajistily vysokou kvalitu spekter a konkurenceschopnou rychlost skenování, což otevírá nové možnosti pro pokročilé proteomické aplikace.

Reference

1. J.E.P. Syka, J.J. Coon, M.J. Schroeder, J. Shabanowitz, D.F. Hunt, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 9528–9533.
2. N.M. Riley, J.J. Coon, Anal. Chem. 2018, 90, 1, 40–64.
3. C.M. Rose, M.J.P. Rush, N.M. Riley, A.E. Merrill, N.W. Kwiecien, D.D. Holden, C. Mullen, M.S. Westphall, J.J. Coon, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2015, 26, 1848–1857.