Advancing phosphorylation, ADMA, and O-GlcNAc PTM analysis with HCD and EThcD on the Orbitrap Excedion Pro mass spectrometer

Analýza fosforylace, ADMA a O‑GlcNAc post‑translačních modifikací pomocí HCD a EThcD na Orbitrap Excedion Pro — technická poznámka

Význam tématu

Post‑translační modifikace (PTM) zásadně ovlivňují funkci, lokalizaci a interakce proteinů a jsou klíčové pro regulaci buněčných signálů, diferenciaci a odpovědi na stres. Přesná identifikace a lokalizace PTM je kritická pro pochopení signalizace a patofyziologie onemocnění, nicméně analýza PTM je náročná kvůli nízké stoichiometrii, labilitě některých modifikací a možnosti více modifikací na jednom peptidu. Moderní hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením a kombinovanými fragmentačními režimy umožňuje tyto výzvy řešit a poskytuje hluboký pohled do PTM krajiny.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je demonstrovat schopnosti hybridního Orbitrap Excedion Pro MS přístroje při analýze tří náročných PTM tříd: fosforylace (včetně fosfotyrosinu), asymetrická dimetylace argininu (ADMA) a O‑spojené glykozylace (O‑GlcNAc). Studie porovnává a kombinuje vyšší energetickou kolizní disociaci (HCD) a elektronový přenos s doplňkovou kolizní energií (EThcD), dokumentuje pracovní postupy obohacení, akvizice dat a následnou bioinformatickou analýzu a ilustruje přínos hybridního přístupu pro lepší lokalizaci a detekci PTM.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: digesty z myšíích tkání (játra, mozek) a lidských buněčných linií (HCT116, MKN‑45); trávení trypsinem nebo LysC.
• Obohacení PTM: PTMScan™ kit pro fosfotyrosin, IMAC Fe‑NTA pro globální fosfopeptidy, PTMScan pro ADMA a O‑GlcNAc.
• Chromatografie: Thermo Vanquish Neo UHPLC se sloupcem Ion Opticks Aurora Ultimate 25×75 XT C18; mobilní fáze s 0,1 % kyselinou formiovou a 80 % acetonitrilem; vysokotlaký přístup a přesně definované gradienty (rychlé režimy pro různé obohacení).
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Excedion Pro hybridní systém s EASY‑Spray zdrojem. Využití automatického nastavování fragmentačních parametrů, nezávislého detektoru náboje pro dynamické řízení AGC a režimů DDA.
• Fragmentace: HCD pro rychlé a citlivé záznamy produktových iontů; EThcD (ETD + doplňková HCD energie) pro zachování labilelních modifikací a lepší pokrytí páteře peptidu; inteligentní HCD‑pd‑EThcD pro selektivní spouštění EThcD pouze při zjištění oxonium iontů (glykopeptidy).
• Parametry akvizice: typické MS1 rozlišení 60 000, MS2 rozlišení 15–30 000, izolace 0.8–1.6 m/z, dynamické vyloučení, nabídkové rozmezí nábojových stavů; specifické nastavení AGC a injekčních časů přizpůsobené typu vzorku.
• Software: Proteome Discoverer (PD) a FragPipe/MSFragger pro fosfo a ADMA analýzy; Byonic a O‑Pair pro O‑glykopeptidovou analýzu; výsledky filtrované na 1 % FDR (prekurzor i proteinová skupina); vizualizace v RStudio/R.

Hlavní výsledky a diskuse

• Fosforylace: IMAC obohacení vedlo k identifikaci 5 892 unikátních fosfosítů kombinací HCD a EThcD; z toho 2 941 unikátních fosfotyrosinových lokalit po PTMScan HS obohacení. Rozložení ukazuje, že 40 % fosfotyrosinových míst bylo detekováno pouze v HCD datech a 15 % pouze v EThcD datech, což potvrzuje komplementaritu obou fragmentačních režimů.
• ADMA: PTMScan HS ADMA obohacení přineslo přibližně 299 jedinečných sekvencí s ADMA modifikací. I když HCD identifikoval více celkových peptidů (vyšší počet PSM), EThcD přinesl více PSM přímo přiřazených k ADMA modifikacím (EThcD: ADMA PSM 798 vs HCD: 555), což vedlo k ~300 jistě přiřazeným ADMA lokusům.
• O‑GlcNAc (O‑glykozylace): použití HCD‑product‑dependent EThcD zlepšilo výkon pro glykopeptidy tím, že HCD skeny slouží k rychlé detekci oxonium iontů a EThcD se spouští jen u kandidátních prekurzorů. Tento postup zvýšil průchodnost (duty cycle) a umožnil přesnou lokalizaci i u peptidů s mnoha potenciálními O‑glykozylačními místy (příklady: HCFC1 peptide s 12 potenciálními místy—2 lokalizované; PCLO peptide, kde stepped‑HCD chybně lokalizoval HexNAc, zatímco EThcD poskytl korektní lokalizaci).
• Spektra a lokalizace: EThcD poskytoval vyšší informaci o páteři peptidu a zachoval modifikace na fragmentech, což zlepšilo pokrytí sekvence a jistotu lokalizace u labilelních modifikací. Nicméně HCD zůstává rychlejším režimem se silným komerčním výstupem pro mnohé peptidy; kombinace obou vedla k nejlepšímu výsledku.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplementární využití HCD a EThcD rozšiřuje celkový počet detekovaných PTM i kvalitu lokalizace, což je zvláště důležité pro biomarker discovery a studium signálních drah.
• HCD‑pd‑EThcD šetří instrumentální čas tím, že spouští náročné EThcD skeny pouze pro glykopeptidy indikované oxonium ionty, čímž zvyšuje produktivitu analýzy O‑glykopeptidů.
• EThcD zlepšuje detekci a přiřazení labilelních modifikací (O‑glykan, fosforylace, ADMA), což vede k vyšší jistotě výsledků v aplikačních scénářích, jako je výzkum nemocí, farmakologie a kvalitativní/procesní kontrola v biotechnologiích.
• Automatické přizpůsobení fragmentačních parametrů a použití nezávislého detektoru náboje (AGC řízení) přispívá k reprodukovatelné vysoké kvalitě spekter napříč peptidy a nábojovými stavy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace inteligentních akvizičních strategií (real‑time detekce modifikačních signálů) s pokročilou analytikou umožní ještě efektivnější průzkum PTM krajiny ve větších kohortách a klinických vzorcích.
• Vylepšení algoritmů pro kombinovanou interpretaci HCD a EThcD (a dalších režimů) zvýší přesnost lokalizace vícečetných modifikací a kvantitativní robustnost.
• Rozvoj specializovaných softwarových nástrojů (např. O‑Pair, rozšíření MSFragger/O‑glycan modulů) a databází glykanů/modifikací podpoří širší adopci O‑glycoproteomiky a natáhne hranice objevných studií v klinickém výzkumu.
• Technologické směry zahrnují rychlejší ETD/EThcD implementace, lepší detektory náboje a optimalizaci duty cycle pro komplexní směsi, což zlepší citlivost na nízce zastoupené PTM.

Závěr

Orbitrap Excedion Pro nabízí vysoce citlivou a flexibilní platformu pro analýzu náročných PTM tříd. Kombinace HCD a EThcD přináší komplementární informace: HCD poskytuje rychlé a citlivé skeny, zatímco EThcD výrazně zlepšuje identifikaci a lokalizaci labilelních modifikací jako jsou O‑glykan, fosforylace a ADMA. Inteligentní HCD‑pd‑EThcD akvizice a moderní bioinformatické nástroje umožňují efektivní a důvěryhodné charakterizace tisíců modifikačních míst v komplexních biologických vzorcích, čímž přispívají k hlubšímu porozumění buněčné regulace a potenciálně i klinickým aplikacím.

Reference

1. Miller RM, Millikin RJ, Rolfs Z, Shortreed MR, Smith LM. Enhanced proteomic data analysis with MetaMorpheus. In: Statistical Analysis of Proteomic Data: Methods and Tools. Methods in Molecular Biology. Humana; 2023. s. 35–66.
2. Saba J, Dutta S, Hemenway E, Viner R. Increasing the productivity of glycopeptide analysis by using higher‑energy collision dissociation‑accurate mass‑product‑dependent electron transfer dissociation. International Journal of Proteomics. 2012;2012:Article ID 560391.
3. Kong AT, Leprevost FV, Avtonomov DM, Mellacheruvu D, Nesvizhskii AI. MSFragger: ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry–based proteomics. Nature Methods. 2017;14(5):513–520.