A Comparative Study of the Intact Mass, Subunit Mass, and Released Glycans of Two Rituximab Biosimilars Using High-Resolution LC/MS

Význam tématu

Vývoj biosimilárních monoklonálních protilátek vyžaduje detailní charakterizaci jejich fyzikálně-chemických vlastností. Masová spektrometrie vysokého rozlišení slouží k identifikaci intact proteinu i jeho podjednotek a k analýze glykosylace, která je klíčovým atributem ovlivňujícím kvalitu, účinnost a bezpečnost biotherapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat dva biosimilary rituximabu s originálním přípravkem pomocí čtyř analytických workflow: intact mAb, redukované podjednotky, IdeS-digested podjednotky a uvolněné glykany. Analýza se zaměřila na přesnost hmotnostních měření, odhalení rozdílů v glykosylaci a citlivost jednotlivých přístupů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky biosimilárů a originálu rituximabu byly analyzovány následujícími postupy:

• Analyza intact mAb bez přípravy vzorku
• Redukce disulfidických vazeb pro vymezení lehké a těžké podjednotky
• Enzymatické štěpení proteázou IdeS pro získání Fc/2 a F(ab')2 fragmentů
• Uvolnění N-glykosidických řetězců, značení InstantPC barvivem a chromatografie s fluorescenční detekcí

Hlavní instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II LC
• Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF
• Agilent AssayMap Bravo pro automatizaci přípravy vzorku
• Kolony PLRP-S a AdvanceBio Glycan Mapping
• Softwarové nástroje Agilent MassHunter a BioConfirm

Hlavní výsledky a diskuse

1. Intact mAb analýza odhalila vysokou přesnost hmotnostních měření glykoform s chybou menší než 10 ppm. Biosimilary vykazovaly mírné odchylky ve složení hlavních glykánů G0F, G1F a G2F.
2. Redukovaná podjednotková analýza umožnila detekci nízkoabundance glykánů Man5 a G0, považovaných za kritické quality atributy.
3. IdeS-digested Fc/2 fragmenty poskytly zvýšenou citlivost díky poloviční hmotnosti analyzátu a odhalily variabilitu C-terminálního odštěpení lysinu u jednoho z biosimilárů.
4. Uvolněné glykany značené InstantPC barvivem a analyzované LC/FLD/MS vykázaly nejvyšší citlivost a přesnost relativní kvantifikace, včetně detekce vzácných struktur afukosylovaných glykánů u druhého biosimiláru.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá identifikace intact mAb pro screening klonů a kontrolu šarže
• Subunit analýza pro středně citlivou charakterizaci glykoform
• Detailní glykoproteomika pro finální kvalifikaci biosimilárů
• Automatizovaná příprava vzorku zkracuje čas a snižuje variability

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj automatizovaných platform pro vysokokapacitní glykoprofily, využití nových fluoroforů s ještě vyšší ionizační účinností a integrace strojového učení pro rychlou interpretaci dat slibují další zefektivnění vývoje a kontroly biotherapeutik. Kombinace subunit a intact mAb přístupů s rozsáhlými glykanalýzami umožní komplexní sledování Critical Quality Attributes během celého procesu výroby.

Závěr

Vysokorozlišující LC/MS platforma Agilent pro intact mAb, subunit a uvolněné glykany je vhodným nástrojem pro komplexní charakterizaci biosimilárních protilátek. Kombinace rychlých a citlivých workflow umožňuje detekci i nízkoabundance glykánů a rozdílů v modifikacích, což je nezbytné pro zajištění kvality a regulační shody.

Reference

• KIRCHHOFF C.F. et al. Biosimilars Key regulatory considerations and similarity assessment tools. Biotechnol. Bioeng. 2017, 114, 2696–2705.
• Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product Guidance for Industry. US FDA 2015.
• CHUNG C.H. et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. N Engl J Med. 2008, 358, 1109–1117.
• TANGVORANUNTAKUL P. et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. PNAS. 2003, 100, 12045–12050.
• Agilent Technologies. A Comprehensive Approach for Monoclonal Antibody N-linked Glycan Analysis from Sample Preparation to Data Analysis. Publ. 5991-8550EN.
• HU Z. et al. Carboxypeptidase D is the only enzyme responsible for antibody C-terminal lysine cleavage in CHO cells. Biotechnol. Bioeng. 2016, 113, 2100–2106.
• Agilent Technologies. LC/MS/MS Peptide Mapping Comparison of Innovator and Biosimilars Rituximab. Publ. 5994-1495EN.
• GOETZE A.M. et al. High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology. 2011, 21, 949–959.
• Agilent Technologies. Streamlined workflows for N-glycan analysis of biotherapeutics Using AdvanceBio Gly-X InstantPC and 2-AB Express. Publ. 5994-1348EN.