Analysis of Antibody siRNA Conjugate Using BioAccord System

Význam tématu

Krátké interferenční RNA (siRNA) patří mezi nadějné terapeutické látky, avšak pro účinné doručení do cílových buněk je nutné použít nosiče. Chemické konjugace siRNA na monoklonální protilátky (Antibody siRNA Conjugates, ARC) umožňují specifickou vazbu a následnou internalizaci do cílových buněk, čímž se zvyšuje efektivita terapie.

Cíle a přehled studie

Cílem tohoto projektu bylo vyvinout a optimalizovat dvě LC-MS metody na systému BioAccord pro komplexní charakterizaci ARC:

• hmotnostní potvrzení sense a antisense řetězců siRNA pomocí iontově párované reverzní fáze (IPRP RPLC-MS),
• určení poměru nákladu léčiva k protilátce (DAR) na finálním ARC pomocí nativní velikostní vylučovací chromatografie s hmotnostní spektrometrií (SEC-MS).

Použitá metodika a instrumentace

Pro hmotnostní analýzu jednotlivých siRNA řetězců byla použita IPRP LC-MS v negativním ionizačním režimu s dekonvolucí spektra metodou MaxEnt 1 v softwaru waters_connect.
Pro stanovení DAR se aplikovala nativní SEC-MS v nedena­turovacím mobile fázi za ESI+ podmínek, aby dvojvláknová struktura siRNA zůstala intaktní.
Instrumentace:

• BioAccord LC-MS System (ACQUITY UPLC I-Class PLUS, tunelovatelný UV detektor, ACQUITY RDa ToF detektor),
• Software waters_connect pro řízení systému a dekonvoluci dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Mass confirmation siRNA: experimentální hmotnosti sense i antisense řetězců odpovídaly teoretickým hodnotám s vysokou přesností.
• RPLC-MS intact protilátky: potvrzení integrity modifikované mAb po náhradě asparaginu cysteinem v Fc oblasti.
• SEC-MS ARC: detekce a dekonvoluce DAR1 a DAR2 populací, včetně vedlejších jednovláknových (sense) konjugátů jako významných nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

Metody na systému BioAccord nabízejí:

• rychlou a robustní analýzu identity a nečistot siRNA-protilátkových konjugátů,
• kompatibilitu s compliant ready softwarem pro snadný přenos metod do QA/QC laboratoří,
• široké možnosti rozšíření na další biopolymerní projekty (intact proteiny, MAM, glykany, oligonukleotidy).

Budoucí trendy a možnosti využití

• integrace multi-attribute monitoring (MAM) pro komplexní kontrolu kvality biokonjugátů,
• rozšíření workflow na další typy nukleotidových konjugátů,
• automatizace a vysokopropustné platformy pro screening různých DAR populací,
• přenos metodiky do regulovaných prostředí pro rutinní analýzu v průmyslových laboratořích.

Závěr

Vyvinuté LC-MS metody na systému BioAccord efektivně potvrdily identitu sense a antisense siRNA a umožnily přesné stanovení DAR u ARC. Systém s compliant ready informatikou usnadňuje přenos do QA/QC a nabízí flexibilní řešení pro analytiku biokonjugátů.

Reference

1. Shion H, Yu Y, Chen W. Enabling Routine and Reproducible Intact Mass Analysis When Data Integrity Matters. Waters Application Note 720006472EN. 2020 October.
2. Shion H, Yu Y, Chen W. Analysis of Antibody Drug Conjugates (ADCs) by Native Mass Spectrometry on the BioAccord System. Waters Application Brief 720006570EN. 2019 May.
3. Doneanu C, Fox J, Harry E, Knowles C, Yu Y, Fredette J, Chen W. Intact Mass Confirmation Analysis on the BioAccord LC-MS System for a Variety of Extensively Modified Oligonucleotides. Waters Application Note 720007028EN. 2020 October.