Assessment of a narrow-window dia-PASEF method for high-throughput proteomics

Význam tématu

Proteomika vyžaduje přesnou kvantifikaci a hluboké pokrytí sekvencí pro pochopení biologických procesů. Data-independent acquisition (DIA) a její pokročilá varianta dia-PASEF využívají dvojrozměrného oddělení iontů (m/z a mobilita) pro zvýšenou separaci a citlivost. Optimalizace metod s krátkými chromatografickými gradienty umožňuje rychlé a spolehlivé analýzy v režimu vysoké propustnosti (high-throughput).

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na vytvoření úzkopásmové dia-PASEF metody s 5 Da izolačními okny pro 15minutový chromatografický gradient. Cílem bylo dosáhnout vysokého počtu identifikací proteinů a peptidů, nízké variability kvantifikace a schopnosti analyzovat jak jednoduché, tak komplexní proteomy v krátkém čase.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byly připraveny tryptické digestáty lidské buněčné linie, kvasinek a Escherichia coli. 800 ng vzorku se naložilo na kolonu Aurora Ultimate (25 cm × 75 µm, IonOpticks) a eluce probíhala 15minutovým gradientem. Měření se uskutečnilo na platformě timsTOF HT (Bruker) s úzkými 5 Da dia-PASEF okny pokrývající oblast m/z 350–900 a mobilitu 0,8–1,1 1/K0. Nastavení cyklu zahrnovalo 44 TIMS frame s 110 MS/MS okny a 10 MS1 rámců; doba akumulace a rampy byla 30 ms. Data byla zpracována bez knihovny pomocí Spectronaut v19 (Biognosys), konverze proběhla přes HTRMS converter s deaktivovanou funkcí slučování MS1 skenů.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza lidského digestu přinesla 8 850 proteinových skupin a 134 728 peptidů ze tří replikací s mediánovou CV na proteinové úrovni 3 % a 8 % na úrovni peptidů. Méně komplexní vzorek kvasinek vedl k identifikaci 4 677 proteinových skupin z 68 744 peptidů, přičemž variabilita zůstala na nízké úrovni. V hybridním vzorku (HeLa: yeast: E. coli v poměru 1:1, 3:2, 2:3) bylo z šesti injekcí detekováno 14 366 proteinových skupin z 170 917 peptidů. Kvantitativní výsledky pro lidské proteiny korespondovaly s teoretickým poměrem 1:1 (medián log2 poměru –0,01), pro kvasinky a E. coli bylo dosaženo hodnot blízkých předpokladu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza: 15min gradient s vysokou propustností.
• Vysoká citlivost a hloubka pokrytí: tisíce proteinů v jedné injekci.
• Přesná kvantifikace: nízká variabilita i u složitých směsí.
• Široké uplatnění: farmaceutický výzkum, QA/QC, screening proteomických změn.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkracování gradientů a automatizace workflow, rozšíření na analýzu malých vzorků či single-cel projekty, integrace umělé inteligence pro pokročilé zpracování dat a real-time rozhodovací algoritmy. Kombinace dia-PASEF s novými iontovými zdroji a kolonnami může dále zlepšit pokrytí a citlivost.

Závěr

Představená úzkopásmová dia-PASEF metoda s 5 Da okny a 15min gradientem poskytuje vysokou propustnost, robustní a přesnou kvantifikaci i pro komplexní proteomy. Vysoký počet identifikací a nízká variabilita potvrzují její vhodnost pro aplikace vyžadující rychlou a spolehlivou proteomickou analýzu.

Reference

• Kaspar-Schoenefeld S., Krieger J., Snyder S., Lubeck M. Assessment of a narrow-window dia-PASEF method for high-throughput proteomics. ASMS2025, TP197.