Deep proteome coverage at scale combined with reproducible quantitation on the timsTOF HT

Význam tématu

Proteomika vyžaduje přesnou a opakovatelnou kvantifikaci proteinů pro detailní pochopení biologických procesů.
Data independent acquisition (DIA) a její varianta dia-PASEF na platformě timsTOF HT přináší kombinaci širokého pokrytí proteomu a spolehlivé kvantifikace s minimem chybějících dat.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo optimalizovat a otestovat dia-PASEF metodu na timsTOF HT při 15minutových gradientech pro jednoduché (kvasinkový, HeLa) i komplexní (směs HeLa, kvasinky a E.coli) proteosomy. Studie hodnotila rozsah pokrytí, opakovatelnost a kvantitativní přesnost.

Použitá metodika a instrumentace

Byly použity tryptické digesty kvasinek (Saccharomyces cerevisiae), lidských HeLa buněk a E.coli.

• Kapalinová chromatografie: nanoElute 2 (Bruker) s Aurora C18 kolonkou (75 µm×15 cm, 1,6 µm částice).
• Mass spectrometrie: timsTOF HT (Bruker) s CaptiveSpray 2 ionizací.
• Gradient: 15minutový ACN gradient.
• DIA parametry: dia-PASEF okna navržená pomocí py-diAID.
• Analýza dat: Spectronaut v18 v library-free režimu (directDIA+), FDR kontrolováno na 1 % u peptidů i proteinových skupin.

Hlavní výsledky a diskuse

• Jednoduché vzorky:
  – Kvasinky: v průměru 4408 proteinových skupin a 50450 peptidů při 15min gradientu.
  – HeLa: téměř 8000 proteinových skupin a 105000 peptidových sekvencí.
• Reprodukovatelnost:
  – 95 % proteinových skupin mělo CV ≤ 20 % v trojích injekcích.
  – Medián CV kolem 5 % na úrovni proteinových skupin.
• Komplexní směsi:
  – Průměrně 12893 identifikovaných proteinových skupin z 173851 prekurzorů.
  – Přibližně 10 peptidů identifikováno a kvantifikováno na protein.
  – Kvantitativní poměry odpovídaly teoretickým hodnotám (log2 poměry blízko 0, s nízkým rozptylem).

Přínosy a praktické využití metody

dia-PASEF na timsTOF HT umožňuje rychlou (15 min) a vysoce výkonnou label-free kvantifikaci s vysokým pokrytím proteomu. Metoda je vhodná pro vysoce propustné biologické studie, industriální QA/QC i výzkumné pracovníky, kteří potřebují robustní a citlivou analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření dia-PASEF přístupu do multi-omics integrace, optimalizace pro ještě kratší gradienty a vyšší dávky vzorku i rozvoj softwarových nástrojů pro automatizovanou analýzu a vizualizaci dat. Zlepšení datové reproducibility a standardizace workflow podpoří široké přijetí v klinických i průmyslových aplikacích.

Závěr

Optimalizovaná dia-PASEF metoda na timsTOF HT dosahuje rozsáhlého pokrytí proteomu, vynikající reprodukovatelnosti a kvantitativní přesnosti při krátkých 15minutových analýzách, což ji řadí k ideálnímu řešení pro vysoce propustné proteomické studie.