Novel real-time acquisition logic to prevent fragmentation of uninformative precursors

Význam tématu

Informativní hmotnostní spektrometrie tandemové analýzy (MS/MS) je klíčová pro přesnou identifikaci a charakterizaci komplexních směsí látek. Moderní spektrometry mohou generovat přes 120 MS/MS spekter za sekundu, avšak mnohé z těchto spekter mohou být neinformativní, pokud jsou fragmentovány soli (addukty), dimery či nežádoucí ionty. Eliminací těchto nepotřebných fragmentací lze zvýšit počet relevantních MS/MS spekter a tím zlepšit hloubku a rychlost analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a otestovat reálný časový de-adduktovací plugin (RTDA) pro software timsControl 4.1 řízený přes APIo rozhraní na spektrometru timsTOF Pro (Bruker). Plugin má zabránit fragmentaci neinformativních sodných a draselných aduktů a dimerních iontů v režimu PASEF, čímž se uvolní kapacita pro fragmentaci významných protonovaných prekurzorů. Metodika byla validována na ethanolovém extraktu sušených tabákových listů a výkonnost srovnána s defaultním režimem PASEF.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byly sušené listy tabáku rozemlety a extrahovány 100% ethanolem po dobu 4 hodin. Extrakt byl dekantován, odstředěn dvojnásobně při 21 000×g, vysušen v rotačním odpařovači a rekonstituován v 80:20 methanol/voda (25 mg/mL). Chromatografická separace probíhala na Waters H-Class Bio UPLC s kolonkou BEH C18 (2,1×50 mm, 1,7 μm) gradientem 5–95 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí při 0,8 mL/min a celkové době běhu 3,5 min.
Data byly zaznamenány v devíti technických replikátech standardní PASEF akvizice a nově vytvořeným RTDA režimem. Zpracování proběhlo v Bruker MetaboScape (4D workflow) včetně feature finding, de-adductingu, de-isotopingu a časové i driftové alignmentu. Statistické hodnocení využilo MetaboScape REST API a Jupyter notebooky s binomickými testy a logistickou regresí.

• Spektrometrie: Bruker timsTOF Pro s timsControl 4.1 (APIo plugin v Pythonu)
• Chromatografie: Waters H-Class Bio UPLC, kolonka BEH C18 2,1×50 mm, 1,7 μm
• Odpařovač: Genevac EZ-2, SP Scientific
• Software: Bruker MetaboScape (4D), MetaboScape REST API, Python, Jupyter

Hlavní výsledky a diskuse

• Celkový počet detekovaných signálů: ~5387 (PASEF) vs. 5283 (RTDA), s vyšším počtem unikátních anotací MS/MS spekter u RTDA (69 vs. 61).
• Poměr fragmentovaných [M+Na]+ a [M+K]+ aduktů se snížil z 0,2825 na 0,1996 díky RTDA.
• Podíl fragmentovaných protonovaných prekurzorů ([M+H]+) vzrostl z 30,52 % na 36,42 %.
• Logistická regrese prokázala vyšší pravděpodobnost získání informativního MS/MS u protonovaných iontů (odds ratios 1,78 pro Na+, 1,46 pro K+).
• Implementace pluginu neovlivnila dobu cyklu PASEF a zajistila konzistentní reprodukovatelnost napříč replikáty.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda RTDA umožňuje efektivnější využití akvizičního času spektrometru tím, že prioritizuje fragmentaci relevantních iontů. Zvýšení počtu informativních spekter přispívá k hloubější charakterizaci metabolitů a dalších sloučenin v komplexních biologických vzorcích a zároveň může snížit potřebu opakovaných analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření real-time selekčních algoritmů o strojové učení pro dynamické rozhodování.
• Adaptace RTDA principu na další typy umělých aduktů a multimerních iontů.
• Integrace s pokročilou bioinformatikou a databázovými platformami pro automatizovanou anotaci.
• Aplikace v oblasti lipidomiky, proteomiky a environmentálních analýz.

Závěr

Reálný časový de-adduktovací plugin pro Bruker timsTOF Pro významně zlepšuje poměr informativních MS/MS spekter díky blokaci fragmentace neproduktivních sodných a draselných aduktů. Metoda neovlivňuje cyklus PASEF, přináší vyšší podíl protonovaných fragmentací a podporuje rychlejší a hloubkovou analýzu komplexních vzorků.