An Online Two-Dimensional Approach to Characterizing the Charge-Based Heterogeneity of Recombinant Monoclonal Antibodies Using a 2D-CEX–AEX–MS Workflow

Význam tématu

Charge heterogenita monoklonálních protilátek významně ovlivňuje jejich stabilitu, farmakokinetiku a účinnost.
Detailní charakterizace těchto variací je proto klíčová pro kontrolu kvality a vývoj bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout integrovanou on-line dvojrozměrnou chromatograficko-hmotnostní metodiku (2D-CEX–AEX–MS) pro rozlišení a identifikaci nábojových variant rekombinantních monoklonálních protilátek (mAb).

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC systém
• Agilent AdvanceBio LC/Q-TOF/MSMS (6545XT)
• Agilent Bio SCX NP5 a Bio SAX NP5 kolony (4,6×250 mm, 5 μm)

Použitá metodika

• První dimenze: kationtoměnná chromatografie (CEX) s amoniakálními acetáty (pH 6,8–9,0), gradient 0–60 % B, průtok 0,4 mL/min, 30 min.
• Druhá dimenze: aniontoměnná chromatografie (AEX) s amoniakálními acetáty (pH 4,5–9,5), gradient 0–60 % B, průtok 0,4 mL/min, 30 min.
• On-line propojení 1D CEX a 2D AEX pomocí 2D válců (2 pozice/8 portů a 6 pozic/14 portů) a kapiláry ASM.
• Peptidové mapování pro potvrzení post-translačních modifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

• 2D-CEX–AEX–MS identifikovala více nábojových variant (13 u mAb I, 9 u mAb II, 11 u mAb III) než samostatné CEX (10; 7; 7) či AEX (8; 4; 7).
• Metoda odhalila široké spektrum modifikací: deamidace, isomerizace Asp, oxidace Met, variace N-glykosylace (G0F/G1F), C-terminální amidace.
• Použití těkavých pufrů umožnilo přímé napojení na MS, minimalizaci artefaktů a detailní dekonvoluci masových spekter.
• 2D přístup významně zlepšil rozlišení koelutujících variant oproti 1D metodám.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní monitoring kvality mAb v bioprocesu a finálním produktu.
• Zvýšení spolehlivosti QA/QC díky lepší detekci subtílních modifikačních profilů.
• Možnost rychlé integrace do existujících LC–MS platforem s minimální úpravou chromatografického systému.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další formy protilátek a bispecifické molekuly.
• Automatizace 2D workflow pro vysokopropustnou analýzu v GMP prostředí.
• Integrace s umělou inteligencí pro automatické vyhodnocení masových spekter a variant.

Závěr

Implementovaná 2D-CEX–AEX–MS metoda představuje robustní nástroj pro detailní charakterizaci nábojové heterogenity mAb. Kombinace orthogonálních technik zajišťuje vyšší citlivost a selektivitu než tradiční 1D přístupy.

Reference

• Grunert, I.; Heinrich, K.; Hingar, M.; et al. Comprehensive Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for the Characterization of Charge Variants of a Bispecific Antibody. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2022, 33, 2319–2327.
• Yan, Y.; Liu, A. P.; Wang, S.; et al. Ultrasensitive Characterization of Charge Heterogeneity of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Strong Cation Exchange Chromatography Coupled to Native Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2018, 90, 13013–13020.
• Kumar, S.; Savane, T. S.; Rathore, A. S. Multiattribute Monitoring of Aggregates and Charge Variants of Monoclonal Antibody through Native 2D-SEC-MS-WCX-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2023, 34, 1263–1271.