Titer and charge-based heterogeneity multiattributemonitoring of mAbsin cell culture harvest using 2D ProACEX MS

Význam tématu

Monitorování heterogenity monoklonálních protilátek (mAb) je zásadní pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti ve fázi vývoje a výroby bioterapeutik. Kombinace stanovení koncentrace (titer) a analýzy nábojových variant v jednom pracovním postupu přináší výrazné zkrácení doby analýzy a eliminuje potřebu samostatných kroků frakcionace a výměny pufrů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat dvoudimenzionální kapalnou chromatografii (2D-LC) s přímým hmotnostním detekčním stupněm (MS), která kombinuje Protein A kolo­nchromatografii pro rychlé stanovení titeru a kationtovou výměnu (CEX) pro rozlišení nábojových variant mAb. Metoda byla aplikována na kultivační supernatant trastuzumabu a jeho biosimilary.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický systém:

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC s autosamplerem, dvěma pumpami, víceřadičovými termostaty a DAD.
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS.

Chromatografické podmínky:

• Dimenze 1: Protein A kolonka Bio-Monolith rProtein A (4,95 × 5,2 mm), proudění 1,0 ml/min, gradient 0–100 % eluční fáze B za 2,5 minuty.
• Dimenze 2: CEX kolonka Agilent Bio SCX NP3 SS (4,6 × 50 mm, 3 µm), proudění 1,0 ml/min, lineární gradient 10–60 % B za 5 minut, teplota 25 °C.
• Použité eluenty obsahují těkavé soli kompatibilní s MS.

MS parametry:

• Teplota sušícího plynu 350 °C, tok 13 l/min, tlak 60 psig.
• Sheath gas: teplota 300 °C, tok 12 l/min.
• Nozálové napětí 5 500 V, fragmentor 175 V.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda 2D ProA-CEX-MS vykázala srovnatelný profil titeru a nábojových variant s konvenčními 1D metodami, avšak s výrazně kratší dobou analýzy: 8 min bez MS a 15 min s hmot­nostní identifikací.
• V CEX chromatogramu bylo rozlišeno šest hlavních nábojových stavů (tři kyselé, tři bazické) a jejich masové odlišení prokázalo typické modifikace (deamidace, isomerizace, sukcinimid).
• Lineární vztah signálu k množství vzorku byl potvrzen v rozsahu 5–160 µg mAb s korelačními koeficienty R2 ≥ 0,9998.
• U vzorků trastuzumabu i čtyř komerčních biosimilárních přípravků (Biceltis, Canmab, Trasturel, Vivitra) byla úspěšně provedena simultánní analýza titeru a nábojových variant bez předchozího čištění.

Přínosy a praktické využití metody

Nová 2D-LC metoda umožňuje:

• Rychlou a robustní multiatributovou kontrolu kvality mAb v průběhu výroby.
• Eliminaci prostojů spojených s manuálními kroky frakcionace a výměny pufrů.
• Jednoduché nasazení v QA/QC laboratořích i ve výzkumných odděleních biotechnologických společností.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace doplňkových dimenzí pro analýzu dalších posttranslačních modifikací (glykolyzace, oxidace).
• Automatizace celého 2D-LC workflow pro vysokoprodukční nasazení v průmyslu.
• Rozšíření přístupu na různé třídy biologik a konjugovaných protilátek.

Závěr

Vyvinutá 2D ProA-CEX-MS metoda představuje efektivní nástroj pro simultánní určení titeru a rozbor nábojové heterogenity mAb v jediném, rychlém workflow. Metoda je plně kompatibilní s hmotnostní spektrometrií, dosahuje vysoké citlivosti a lineárního rozsahu a umožňuje podpořit hodnocení biosimilárních produktů.

Reference

• Murisier A. et al., Towards a simple on-line coupling of ion exchange chromatography and native mass spectrometry for the detailed characterization of monoclonal antibodies, J. Chromatogr. A, 1655 (2021) 462499.
• Rogers R.S. et al., Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics, mAbs, 7 (2015) 881–890.
• Rathore A.S., Sarin D., What should next-generation analytical platforms for biopharmaceutical production look like?, Trends Biotechnol., (2023) 1–11.
• Sarin D., Kumar S., Rathore A.S., Titer and charge-based heterogeneity multiattribute monitoring of mAbs in cell culture harvest using 2D ProA CEX MS, Talanta, 276 (2024) 126232.