Advanced Characterization of Semaglutideand Its Impurities Using a Heart-Cutting 2D-LC/MS Workflow for Biopharmaceutical Analysis

Význam tématu

Semaglutid je syntetický peptid terapeuticky využívaný při léčbě diabetu 2. typu a obezity. Profilování nečistot je klíčové pro zajištění bezpečnosti a účinnosti, protože peptidy mohou obsahovat delece, inserce, izoformy či truncace, které často koeluji s hlavní složkou v konvenčních 1D-LC/MS metodách.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout heart-cutting 2D-LC/MS workflow spojující vysokorozlišovací 1D separaci v fosfátovém pufru a MS-kompatibilní desalting ve druhé dimenzi. Analýza proběhla na systému Agilent 1290 Infinity III Bio 2D-LC ve spojení s hmotovým spektrometrem 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a softwarem BioConfirm pro automatizovanou sekvenční analýzu.

Použitá metodika

• 1D chromatografie: AdvanceBio Peptide Plus (2.1×250 mm, 2.7 μm); mobilní fáze A: 25 mM fosfátový pufr pH 4,5 a acetonitril (70:30), fáze B: 30:70; gradient 0–60,5 min; průtok 0,6 ml/min; teplota kolony 45 °C; detekce UV při 215 nm.
• Heart-cutting a HiRes sampling: víceřezové odběry do 40 μl biokompatibilních loopů s cílem zachytit celé spektrální profily špiček.
• 2D chromatografie: AdvanceBio RP-mAb C4; mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, B: 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu; průtok 0,4 ml/min; teplota 50 °C; cyklus 23 min; ASM nastavení faktor 3, flush faktor 5.
• MS parametry: hmotový spektrometr 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF; teplota plynu 325 °C, napětí VCap 4 000 V, rozsah m/z 300–3 200, auto MS/MS rozsah 50–3 200; izotopový model Peptides, selekce prekurzorů dle intenzity.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity III Bio 2D-LC systém: flexibilní pumpa (G7131A), high-speed pumpa (G7132A), multisampler (G7137A), multikolonový termostat (G7116B), variabilní vlnový UV detektor (G7114B), diode array detektor (G7117B) a BioMultiHeartCut set-up.
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF.
• Software BioConfirm pro automatizovanou identifikaci sekvencí a modifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

Experiment 1 se zaměřil na pre-main region, kde HiRes frakce identifikovaly izomery semaglutidu a truncované fragmenty (7–31, 19–21). 2D EIC pro m/z 4111,13 prokázala oddělení isomerů a fragmentů. Experiment 2 zkoumal hlavní a post-main region; v deseti HiRes frakcích byly detekovány varianty Des-HA (2–31), Des-H (3–31) a další truncace. Multi-injekce zajistila přenos všech heart-cutů a kompletní akvizici MS dat. BioConfirm potvrdil sekvenci semaglutidu s Aib na pozici 2 a C18 řetězcem na Lys20, s tolerancí MS ±10 ppm a MS/MS ±20 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje efektivní oddělení a identifikaci nízkohustotních koelujíčích nečistot.
• Podporuje komplexní profilování GMP šarží pro farmaceutickou kontrolu kvality.
• Automatizované zpracování pomocí BioConfirm zvyšuje reprodukovatelnost a objektivitu analýz.
• Integrované desaltingové kroky minimalizují přípravu vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na jiné terapeutické peptidy a proteiny.
• Integrace s real-time QC systémy v GMP prostředí.
• Využití strojového učení a umělé inteligence pro pokročilou interpretaci dat.
• Adaptace na analýzu vysoce molekulárních makromolekul, vakcín a cílených biologik.

Závěr

Navržený 2D-LC/MS workflow s heart-cuttingem, HiRes samplingem a multi-injekcí prokázal vysokou účinnost při separaci a identifikaci semaglutidu a jeho nečistot. Systém Agilent 1290 Infinity III Bio 2D-LC ve spojení s 6545XT LC/Q-TOF a softwarem BioConfirm poskytuje přesná hmotnostní a sekvenační data, což z něj činí robustní řešení pro vývoj a kontrolu kvality peptidových léčiv.

Reference

1. Khandpur P.; Bharatiya P.; Pargaonkar A. Advanced 2D-LC/Q-TOF Workflow for Impurity Characterization of GLP-1 Therapeutic Peptide Semaglutide. Agilent Technologies Application Note 5994-8288EN, 2025.