Comprehensive characterization of oligonucleotides and related impurities using advanced LC/Q-TOF analytical workflows

Význam tématu

Therapeutické oligonukleotidy (např. antisense oligonukleotidy) vykazují vysokou sekvenční specifičnost, avšak jejich syntetická povaha vede k heterogenitě výrobků. Precizní profilování nežádoucích variant (trunkace, modifikace páteře PS→PO, depurinace, abasic lokusy, prodloužení) je kritické pro bezpečnost a účinnost léčiv v rámci vývoje i GMP kontroly kvality. Robustní analytické workflow, která kombinují chromatografii a hmotnostní spektrometrii, umožňují identifikaci nízkomolekulárních a koelujících nečistot, což snižuje regulační rizika a zvyšuje spolehlivost charakterizace produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat komplexní 2D-LC/Q-TOF workflow pro detailní charakterizaci oligonukleotidu nusinersen a souvisejících nečistot. Autoři implementovali orthogonální 2D separaci (ion-pair RP v 1. dimenzi a HILIC-Z v 2. dimenzi), kombinovanou s multi-heart-cut (MHC) a HiRes multi-inject sampling, a následnou analýzou na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s podporou softwaru MassHunter BioConfirm. Hlavní záměr byl zvýšit rozlišení koelujících variant, zlepšit desaltování pro MS a umožnit detekci stopových nečistot s potvrzením sekvence pomocí MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Metodický přístup zahrnoval dvě chromatografické dimenze:

• 1. dimenze (RP, ion-pair): mobilní fáze na bázi 0,2 % dibutylaminu (DBA) a 0,2 % HFIP v vodě, směrování s methanolem (poměry A/B uvedeny v původní metodě). Kolona: Altura Oligo HPH-C18 (4.6 × 150 mm, 2.7 µm), teplota 30 °C, detekce UV 260 nm. Průtok 0.4 ml/min, injekce 10 µL.
• 2. dimenze (HILIC-Z, MS-kompatibilní desalting): 15 mM amonný acetát v vodu; mobilní fáze A: acetonitril:acetát (70:30 v/v); kolona: Altura Poroshell HILIC-Z (2.1 × 100 mm, 2.7 µm), teplota 30 °C, průtok 0.3–0.4 ml/min. 2D cyklus ~46 min s faktorem transferu a flush faktorem optimalizovaným pro MHC.
• Sampling a transfer: multi-heart-cut (MHC) a HiRes multi-inject s biokompatibilními smyčkami (více 40 µL smyček emulujících velké smyčky) pro přenos cílených frakcí z 1D do 2D a zvýšení propustnosti.
• MS nastavení: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF v negativním módu, rozsah m/z 400–3200 (auto MS/MS 50–3200), VCap 4500 V, fragmentor 180 V, teplota plynu 350 °C, suchý plyn 13 L/min, mlžič 35 psi, toleranční limity použití v BioConfirm: MS ±10 ppm, MS/MS ±20 ppm.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity III Bio 2D-LC (Flexible Pump G7131A; High-Speed Pump G7132A; Multisampler G7137A; Multicolumn Thermostat G7116B; VWD G7114B; DAD G7117B; MHC konfigurace).
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF.
• MassHunter BioConfirm software pro automatizované přiřazení sekvence a identifikaci nečistot.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové výstupy studie:

• 2D-LC oddělila koelující špičky, které v 1D koelují s hlavním produktem; použití RP (ion-pair) v 1. dimenzi a HILIC-Z v 2. dimenzi umožnilo efektivní desaltování a zvýšení citlivosti MS.
• HiRes MHC a multi-inject sampling umožnily cílený přenos více frakcí najednou (až 10 heart-cutů na běh), čímž se zvýšila propustnost a udrželo vysoké rozlišení.
• MassHunter BioConfirm automaticky přiřadil plnou délku nusinersenu (FLP) a různé isoformy, truncace a degradační produkty. Byly identifikovány konkrétní varianty: N-1 truncace, sekvence s přeměnou PS→PO a další drobné modifikace.
• MS/MS fragmentace poskytla sekvenční pokrytí (y, b, w ionty) dostatečné pro potvrzení identity hlavního produktu i nečistot; příklady ukázaly potvrzení N-1 truncace a PS→PO konverze na základě charakteristických terminálních iontů a ztrát.
• Workflow umožnil detekci nízkoabundantních nečistot, které by v konvenční 1D-LC/MS zůstaly skryté kvůli koeluci nebo potlačení signálu solí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí několik praktických výhod:

• Zvýšená schopnost identifikovat a charakterizovat koelující a stopové nečistoty v oligonukleotidech, což je zásadní pro vývoj léčiv a kontrolu kvality (GMP).
• MS-kompatibilní desalting ve 2. dimenzi snižuje iontové potlačení a zlepšuje poměr signál/šum pro nízkoúrovňové komponenty.
• MHC a multi-inject přístup zvyšují výtěžnost informací bez nutnosti zásadního prodloužení času analýzy nebo hardware úprav.
• Automatizované přiřazení pomocí BioConfirm urychluje interpretaci dat a zvyšuje konzistenci výsledků pro regulační dokumentaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• Integrace iontové mobility pro další rozlišení izomerů a konformačních variant oligonukleotidů.
• Větší automatizace MHC strategií a optimalizace multi-inject protokolů pro vysokoprůtokové rutinní testování.
• Pokročilé datové nástroje a strojové učení pro rychlejší rozpoznání vzorců degradace a predikci potenciálních nečistot během syntézy.
• Rozšíření aplikace na další modifikované nukleové kyseliny (siRNA, mRNA fragmenty, aptamery) a jejich specifické analytické výzvy.

Závěr

Prezentované 2D-LC/Q-TOF řešení kombinuje orthogonální chromatografii, MHC/HiRes sampling a výkonné Q-TOF MS s dedikovaným softwarovým workflow. Tento integrovaný přístup významně zlepšuje schopnost oddělit, detekovat a definitivně identifikovat koelující a nízkoabundantní nečistoty v komplexních oligonukleotidech jako je nusinersen. Výsledkem je robustní analytický nástroj vhodný pro vývoj terapeutických oligonukleotidů a podporu regulačních požadavků.

Reference

1. Analysis of GLP-1 Agonists Using the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System and Altura Ultra Inert HPLC Column. Agilent publication number 5994-8837EN, 2025.